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ICSI周期未成熟卵母细胞24h体外成熟后受精发育潜能和临床结局分析

2023-10-27 267 上传者：管理员

摘要：目的研究胞浆内单精子注射(ICSI)周期中未成熟卵母细胞体外培养24 h成熟后进行ICSI的受精、发育潜能和临床结局，以期为未成熟卵母细胞的临床应用提供参考。方法回顾性分析华中科技大学同济医学院附属同济医院生殖医学中心2018年1月—2021年10月行辅助生殖助孕治疗的不孕症患者的临床资料，以ICSI周期中未成熟卵母细胞比例>50%的69例患者作为研究对象，将263枚24 h体外成熟(IVM)的卵母细胞(B组)与来自相同周期的241枚体内成熟的同胞卵母细胞(A组)进行对比，分别比较两组胚胎的受精、发育潜能及临床结局。结果 B组成熟的卵母细胞(MII)比率59.63%明显高于A组的34.63%,差异有统计学意义(P<0.01),两组其余的基础资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)。在受精方面，B组2原核(2PN)受精率50.57%与A组的51.45%接近；1PN率3.42%、3PN率3.42%和退化(DA)率16.73%与A组相比(分别为2.07%、3.32%、12.45%)呈升高趋势，但差异均无统计学意义(P>0.05)。B组第3天(D3)继培数68.42%较A组的50.81%明显增多，D3优胚率15.79%和可利用囊胚率20.88%较A组(分别为28.23%、39.68%)明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05);第2天(D2)卵裂率90.98%、囊胚形成率34.07%、优质囊胚率8.79%与A组相比(分别为95.97%、49.21%、11.11%)呈下降趋势，但差异均无统计学意义(P>0.05)。A组复苏移植18例：妊娠3例(分娩1例，正在进行的妊娠2例);B组复苏移植15例：妊娠3例(分娩2例，正在进行的妊娠1例),分娩胎儿均健康无畸形及并发症。结论对于MII卵母细胞较少的ICSI周期，未成熟卵母细胞体外培养24 h成熟后进行ICSI具有一定的临床应用价值，充分利用这部分卵母细胞可以提高卵子利用率和增加妊娠机会。

关键词：
24 h体外成熟
临床结局
发育潜能
受精
未成熟卵母细胞
胞浆内单精子注射
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随着辅助生殖技术(assisted reproductive technology, ART)飞速的发展，促排卵技术及体外培养条件的全面提高，获得卵母细胞的数量和质量都有了一定改善，但是仍然不可避免地出现少部分患者大部分卵母细胞不成熟的情况。胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)周期中，卵冠丘复合物(cumulus oocyte complexes, COCs)剥除卵丘细胞后通常将未成熟卵母细胞直接丢弃，若患者大部分卵母细胞不成熟直接丢弃则十分可惜，如果将这部分卵母细胞继续培养成熟后加以利用，可能会提高卵子利用率，改善患者的临床结局。本研究回顾性分析华中科技大学同济医学院附属同济医院生殖医学中心2018年1月—2021年10月行辅助生殖助孕治疗的不孕症患者的临床资料，探讨未成熟卵母细胞体外培养24 h成熟后进行ICSI的临床应用价值，以期为未成熟卵母细胞的临床应用提供参考。

1、资料与方法

1.1研究对象

回顾性分析华中科技大学同济医学院附属同济医院生殖医学中心2018年1月—2021年10月行辅助生殖助孕治疗的不孕症患者的临床资料，将ICSI周期中卵母细胞未成熟比例>50%的69例患者作为研究对象，并将263枚24 h体外成熟(IVM)的卵母细胞(B组)与来自相同周期的241枚体内成熟的同胞卵母细胞(A组)进行对比，分别比较两组胚胎的受精、发育潜能和临床结局。纳入标准：①ICSI周期；②未成熟卵母细胞(GV或MI)比例>50%。排除标准：新鲜卵子和复苏卵子同时进行ICSI的患者。本研究通过本院医学伦理委员会批准，所有患者夫妻双方均了解并知情同意。

1.2研究方法

1.2.1卵母细胞收集及脱颗粒

按照本中心常规方案促排卵，肌内注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)10 000 U,36 h后在阴道超声监测下穿刺取卵。取出卵母细胞后将卵冠丘复合物(COCs)置于培养液G-IVF(vitrolife,瑞典)于培养箱中培养(37℃,6%CO2),获卵后2～4 h按照采卵的先后顺序用80 IU/ml的透明质酸酶(vitrolife,瑞典)消化COCs并用stripper(140um, cook,美国)机械法去除颗粒细胞，并在显微镜下观察判断卵母细胞的成熟情况。若患者卵母细胞成熟比例<50%会在脱颗粒后适当延长ICSI前的孵育时间，对于当日ICSI注射后仍有>50%卵母细胞未成熟的患者，本中心常规将未成熟卵母细胞过夜培养24 h(平均时间23.6 h,范围19.7～27.5 h)至次日，体外成熟(in vitro maturation, IVM)的培养液是G-1(vitrolife,瑞典),未额外添加任何培养成分，若有卵母细胞成熟则在患者知情同意的原则下再次行ICSI,第二天ICSI所用精子仍为取卵当天所留精子，当日ICSI注射后精子被保存在培养箱中过夜。24 h IVM的卵母细胞进行ICSI注射后受精及胚胎评估均推迟1 d。

1.2.2受精情况评估

本中心常规于授精后16～18 h评估原核，取卵当日为D0,次日为D1,D1评估卵子受精情况并记录原核(pronucleus, PN)数目：2PN为正常受精；NPN为未受精；1PN和3PN分别为1个原核和3个原核的异常受精。

1.2.3卵裂期(D2/D3)胚胎评估

本中心D2/D3卵裂胚评分标准：1级：卵裂球大小均匀且碎片≤5%;2级：卵裂球大小均匀或稍不均匀且碎片≤20%;3级：卵裂球大小严重不均且碎片<50%,或卵裂球无大小严重不均、碎片20%～50%;4级：胚胎卵裂球少，碎片≥50%。D2卵裂指的是D1为正常受精(2PN),D2卵裂球数为≥2个。正常受精胚胎第3天≥6细胞，细胞均匀或略不均匀，碎片≤20%。只有当没有其他质量好的MII卵母细胞胚胎时才选择来自IVM的MII卵母细胞的胚胎进行移植。本中心常规将D3移植胚胎以外剩余的胚胎继续培养，继续培养胚胎标准：D3细胞数≥4个，碎片50%以下。D3优质胚胎标准：D1为正常受精(2PN),D2卵裂球数为4～5个，D3卵裂球数7～10个，卵裂球大小均匀且碎片<10%。

1.2.4囊胚(D5/D6)评估

本中心采用Gardner囊胚评分系统对囊胚进行质量评估[1],根据囊胚腔扩张程度分为6期：1期：囊腔出现，囊腔范围小于胚胎体积的一半；2期：囊腔范围等于或大于胚胎体积的一半；3期：囊腔占满胚胎，但未完全扩张；4期：囊腔完全扩张，体积增大，透明带薄；5期：囊胚正从透明带(zona pellucida, ZP)孵出；6期：囊胚完全从ZP孵出。再根据内细胞团(inner cell mass, ICM)和滋养层细胞(trophectoderm, TE)的形态和数目对囊胚质量进行分级，ICM分级：细胞数目多，排列紧密为A级；细胞数目少，排列松散为B级；细胞数目很少为C级。TE分级：细胞数目多，结构致密为A级；细胞数目少，排列松散为B级；细胞数目很少为C级。冷冻囊胚标准：D5/D6囊胚评分≥3/4BC。优质囊胚标准：D5/D6囊胚评分≥3/4BB。

1.3统计学分析

采用SPSS 26.0统计学软件包进行统计分析，符合正态分布的计量资料数据用均数±标准差(x¯±s)表示，组间均数比较采用t检验，率与构成比的组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1两组基本情况比较

59.63%的卵母细胞经过24 h体外培养后成熟，B组MII率显著高于A组，差异有统计学意义(P<0.01);两组的年龄、不孕年限、原发不孕比例、体质指数(BMI)比较差异均无统计学意义(P>0.05)。两组患者的基本情况比较见表1。

2.2两组患者受精情况比较

在2PN受精率方面，B组正常受精率与A组相似，1PN率、3PN率和退化率(degradation rate, DA)呈升高趋势，但差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1两组患者的基本情况比较[例(%),x¯±s]

2.3两组患者胚胎发育情况比较

与A组患者相比，B组D3继培数明显增多，D3优胚率和可利用囊胚率明显下降，两组比较差异均有统计学意义(均P<0.05);与A组患者相比，D2卵裂率、囊胚形成率、优质囊胚率明显下降，但两组比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。两组患者胚胎发育情况比较见表3。

表2两组患者受精情况比较[例(%)]

表3两组患者胚胎发育情况比较[例(%)]

2.4两组患者临床结局分析

以子宫内膜达到移植标准的复苏周期为妊娠结局比较标准。部分患者新鲜周期已经妊娠，且A组患者MII卵母细胞中没有质量好的胚胎移植时，才从B组患者24 h IVM的MII卵母细胞中选择胚胎移植。截至2021年10月21日，B组复苏移植15例：妊娠3例(其中分娩2例，正在进行的妊娠1例);A组复苏移植18个周期：妊娠3例(其中分娩1例，正在进行的妊娠2例),分娩胎儿均健康，无畸形及并发症。两组患者妊娠结局比较见表4。

表4两组患者妊娠结局比较[例(%)]

3、讨论

常规促排卵周期中约有15%～20%的卵母细胞未成熟[2],通常只有在体内成熟的MII卵母细胞才被用于ICSI,ICSI周期不成熟的卵母细胞全部被丢弃。在临床工作中，若患者卵母细胞成熟比例<50%会在脱颗粒后适当延长ICSI前的孵育时间，但仍有少部分患者在取卵当天注射完毕后大部分卵母细胞不成熟，如果将不成熟卵母细胞全部丢弃非常可惜，若能将这部分卵母细胞充分利用，对于获得MII卵母细胞较少的患者是有价值的。

目前针对未成熟卵母细胞的研究主要是人卵母细胞体外成熟培养(in vitro maturation, IVM)技术，为了更好地了解卵母细胞成熟的分子和遗传机制，提高受精和移植卵母细胞的产量，人们对卵母细胞的IVM进行了大量的研究。未成熟卵母细胞的IVM包括卵巢受刺激或未受刺激的周期、卵丘保留或卵丘剥离，以及体外培养成熟的时间不同，从4～48 h不等[3]。在本研究中，从接受卵巢刺激的ICSI周期中提取未成熟卵母细胞，旨在不改变原有的卵巢刺激、卵母细胞提取、ICSI程序、胚胎培养或移植的常规下，将24 h体外自发成熟的卵母细胞进行延迟ICSI,评估24 h IVM的卵母细胞的发育潜力，探讨其是否可以增加卵子利用率，改善患者临床结局。

既往有多项研究分析未成熟卵母细胞体外培养的成熟情况，Chian等[4]将MI卵母细胞放在IVM培养液和普通细胞培养液(TCM-199)体外培养6 h后成熟率分别为52.0%和46.1%;Strassburger等[5]将MI卵母细胞在体外培养4 h后成熟率为45.1%;Vanhoutte等[6]研究认为卵母细胞的成熟过程有时间依赖性，MI卵母细胞体外培养2～4 h后成熟率为41%,4～7 h后成熟率为42%,7～11 h后成熟率为67%,19～26 h后成熟率为75%。David等[3]对41个周期的263个未成熟卵母细胞(GV和MI)体外培养24 h后总成熟率为47.9%。本研究中69例患者共获得696枚COCs,脱颗粒后发现仅241枚MII卵母细胞(34.63%),14枚卵母细胞发生退化，其余441枚卵母细胞(GV和MI)继续培养24 h后，共有263枚(59.63%)卵母细胞成熟，每个周期至少有一枚卵母细胞成熟，MII率与体内成熟组比较差异具有统计学意义(59.63% vs. 34.63%,P<0.01)。各文献报道的MII率不同可能与体外培养时间不同以及获取COCs时卵母细胞处于减数分裂成熟的阶段(GV期或MI期)不同有关；此外，不同的培养条件、培养液类型、是否添加血清、生长因子和激素都有可能会影响卵母细胞体外培养的成熟率。

Devos等[7]对896个ICSI周期进行回顾性分析发现，与8 803个体内成熟的卵母细胞相比，1 210个MI卵母细胞体外培养4 h成熟后进行ICSI 2PN受精率下降(52.7% vs 70.8%,P<0.01),但两组具有相近的胚胎质量。Vanhoutte等[6]分析187个至少含有1个MI卵母细胞和最多6个MII卵母细胞的ICSI周期，将MI卵母细胞体外培养后按成熟时间不同进行分组，受精率的差异与培养时间有关，2～4 h受精率为43%,>4～7 h受精率为54%,7～11 h受精率为100%,19～26 h受精率为67%,总的MI卵母细胞IVM的2PN受精率低于体内成熟同胞卵母细胞，差异有统计学意义(52% vs 68%,P<0.05),IVM来源的卵母细胞中质量差的胚胎比例明显较高。David等[3]对263个卵丘剥除后未成熟卵母细胞(GV和MI)进行24 h体外培养，与来自相同周期的234个体内成熟同胞卵母细胞进行比较，两组2PN受精率相似，差异无统计学意义(62.1% vs.64.0%,P>0.05);与无IVM的ICSI周期相比，IVM组第2天胚胎细胞数量明显减少，碎片化趋势升高以及不对称性分布增加。此外，多项研究也认为卵母细胞体外成熟后不良胚胎比例较高，IVM后出现更多的卵裂阻滞[8,9],更多的多核卵裂球[8],以及发育到囊胚期[10]的胚胎减少。

本研究中未成熟卵母细胞24 h IVM后2PN受精率与体内成熟组相似(50.57% vs. 51.45% ,P>0.05),与David[3]研究一致，其他研究报道2PN受精率下降，可能是因为体外培养时间短，胞质/胞核成熟不同步有关。Balakier等[8]对MI卵母细胞IVM时第一极体排出时间进行精确记录发现，当第一极体排出后3～6 h注射卵母细胞时受精率最高，多核发生率最低。这说明在达到MII阶段时卵母细胞成熟尚未完成，而只有胞核/胞质同步成熟的卵母细胞才具备良好的受精能力及胚胎发育潜能[11,12,13]。虽然本研究未成熟卵母细胞24 h IVM后2PN受精率与体内成熟组相似，但D3优质胚胎率和可利用囊胚率明显下降，与之前其他文献报道IVM来源的卵母细胞胚胎质量下降一致[3,6]。IVM来源的卵母细胞胚胎质量下降可能是较长的IVM孵育时间导致卵母细胞老化[7],此外，长时间体外培养，可能会导致氧自由基大量积聚，增加了卵子氧化应激损伤、非整倍体率增加及胚胎发育阻滞的风险[14,15]。

Vanhoutte等[6]将187个ICSI周期中的MI卵母细胞体外培养不同时间后成熟，移植了13例完全来源于IVM卵母细胞的胚胎，最终获得了一次妊娠和活产，这例活产来自一个在体外培养22 h后成熟的卵母细胞。Edirisinghe等[16]报道了1例24 h IVM卵母细胞ICSI注射受精后原核期冷冻，解冻后移植，最终生下1名健康男婴。虽然本研究来源于24 h IVM卵母细胞的胚胎优质胚胎减少，但从临床结局来看，B组复苏移植15例：妊娠3例(分娩2例，正在进行的妊娠1例),分娩胎儿均健康，无畸形及并发症。由此可见，在不改变原有方案的情况下，24 h IVM的卵母细胞进行ICSI提高了卵子利用率，增加了患者妊娠机会。

综上所述，对于获得MII卵母细胞较少的ICSI周期，未成熟卵母细胞经体外培养24 h成熟后具有一定的临床应用价值。在以后的研究中，我们可以对未成熟卵母细胞体外培养进行亚组分析，分别观察处于减数分裂成熟不同阶段(GV期或MI期)的卵母细胞体外培养成熟后的临床结局；同时未成熟卵母细胞IVM联合时差监测系统(timelapse)进行动力学研究，观察第一极体排出时间，根据卵母细胞成熟时间调整最佳的ICSI时机，改善卵母细胞的胞核/胞质成熟同步化，以期进一步提高未成熟卵母细胞的临床利用价值。

文章来源:李丹,余琼,任新玲等.ICSI周期未成熟卵母细胞24h体外成熟后受精发育潜能和临床结局分析[J].中国妇幼保健,2023,38(21):4184-4188.