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aCGH应用于产前诊断意外发现DMD基因缺失或重复病例分析

2024-05-28 274 上传者：管理员

摘要：目的探讨微阵列比较基因组杂交(aCGH)技术应用在产前诊断中发现抗肌萎缩蛋白基因(又称DMD基因)缺失或重复的重要价值。方法收集2019年9月至2020年7月在西北妇女儿童医院因高危因素(高龄、血清学筛查高风险、无创筛查高风险或超声软指标异常等)选择aCGH技术进行产前诊断的851例孕妇的羊水样本进行检测，并进一步采用多重连接探针扩增(MLPA)方法对DMD基因变异样本进行验证。结果在851例孕妇的羊水样本中，经aCGH产前诊断时意外发现4例羊水样本存在DMD基因缺失或重复，同时MLPA检测验证了上述变异。胎儿1:男胎，arr[GRCh37]Xp21.1(31691172-31766673)×0,DMD基因E52-53缺失；胎儿2:男胎，arr[GRCh37]Xp21.2(31016983-31351900)×2,DMD基因E61-79重复；胎儿3:女胎，arr[GRCh37]Xp21.2(31182699-31474949)×3,DMD基因E58-74重复；胎儿4:男胎，arr[GRCh37]Xp21.1(31777925-32152126)×2,DMD基因E45-51重复。4例变异均遗传自母亲。结论产前诊断是防止DMD患者出生的重要手段，aCGH技术用于产前诊断不仅可以检测染色体微缺失和微重复综合征，还有助于检测由基因缺失或重复引起的单基因疾病，从而为临床诊断及遗传咨询提供了理论依据。

关键词：
产前诊断
多重连接探针扩增
微阵列比较基因组杂交
抗肌萎缩蛋白基因
营养不良
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Duchenne型肌营养不良症(duchenne muscular dystrophy, DMD)是临床中最常见的进行性肌营养不良症，由位于染色体Xp21.1的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因(又称DMD基因)突变引起[1]。大多数患者为男性，女性一般为致病基因携带者。DMD在活产男婴中的发病率接近2.86/万(1/3 500)[2]。DMD临床典型特征为对称性的近端肌肉无力伴腓肠肌假性肥大，患者一般在3～5岁时出现症状，进行性加重，直至失去行走能力，在30岁左右死于心肺衰竭。约40%的DMD病例为新发突变[3],无DMD家族史，一般在出生后才能被发现。微阵列比较基因组杂交(array comparative genomic hybridization, aCGH)等新技术广泛应用于产前诊断后，越来越多的染色体微缺失和微重复被检测到，甚至可能有一些意想不到的发现。本研究收集了2019年9月到2020年7月在西北妇女儿童医院因高危因素(高龄、血清学筛查高风险、无创筛查高风险或超声软指标异常等)选择aCGH技术进行产前诊断的851例孕妇的羊水样本进行检测，意外发现4例胎儿存在DMD基因外显子重复或缺失，报告如下。

1、资料与方法

1.1临床资料

孕妇1,34岁，孕1产0,孕21周+3天，B超提示胎儿(胎儿1)脐膨出。本次系因多囊卵巢促排妊娠，否认孕期不规则出血史，否认其他有毒有害物质接触史，无宠物接触史。平素月经规律，乙肝小三阳携带，丈夫体健。其妹生育1儿1女，均体健。孕妇及其丈夫无遗传病家族史。

孕妇2,33岁，孕2产1,孕26周+5天，B超提示胎儿(胎儿2)右位主动脉弓伴左侧锁骨下动脉迷走、胎儿左心室强光点，产前血清学筛查未见异常。本次妊娠有感冒史，咳嗽病史，口服桔贝合剂。孕前诊断为抑郁症，服用抗抑郁药(安定、百解忧等)1个月，停药20天后停经。既往月经规律，生育1女，半年前女儿患特异性皮炎。孕妇既往鼻炎病史，无遗传病家族史。

孕妇3,33岁，孕3产1,孕27周+3天，孕22周时系统B超提示胎儿(胎儿3)颈后皮肤皱褶(nuchal fold, NF)增厚(6.8mm),胎儿心脏B超未见明显异常，产前血清学筛查示唐氏临界风险(1∶413),孕妇外周血胎儿游离DNA无创产前检测(noninvasive prenatal test, NIPT)低风险。10年前(2010年)顺产1男婴，目前体健[孕妇自述，后经多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)检测确定该男童为DMD外显子部分重复]。否认孕期有毒有害物质接触史，既往体健，无遗传病家族史。

孕妇4,32岁，孕1产0,孕28周+5天，B超提示胎儿(胎儿4)骶尾椎先天发育异常，左侧侧脑室后角增宽至10mm,胎儿心脏B超未见明显异常。本次因不孕行试管助孕，一代试管失败，二代试管补救后妊娠，种植1枚胚囊，产前血清学筛查低风险，NIPT低风险，既往体健，无遗传病家族史。

本研究已通过西北妇女儿童医院医学伦理委员会审批(2023-013)。所有孕妇及家属均签署书面知情同意书。

1.2方法

1.2.1 DNA的提取

所有孕妇均行羊膜腔穿刺术，抽取羊水10mL,离心收集羊水中的细胞。使用PureGene组织提取试剂盒(Qiagen,德国)提取羊水基因组DNA,进行aCGH和MLPA检测。抽取孕妇外周血3～4mL,使用血液基因组DNA试剂盒(天根，北京)提取外周血DNA,进行MLPA检测。为了确保结果的准确性，使用荧光标记短串联重复序列(short tandem repeats, STR)复合扩增检测试剂盒(阅微，江苏)对羊水和孕妇外周血的DNA进行扩增，以分析待检样本中是否存在母体细胞污染。

1.2.2 aCGH的检测

检测方法参照有关参考文献[4]。按照aCGH技术流程进行标记、纯化、杂交、洗涤。试剂盒均为Technologies Agilent公司生产，杂交芯片为美国Agilent Technologies公司生产的PerkinElmer CGXTM(8×60K)芯片。使用SureScan微阵列扫描仪(Agilent Technologies,美国)扫描芯片，并使用Cytogenomics软件(Agilent Technologies,美国)分析结果。最后，使用Genoglyphix®(https: //uk.genoglyphix.com/)在线判读数据并进行分析。参考DGV、DECIPHER、ISCA、OMIM、ClinVar、PubMed等公共和实验室数据库，针对≥100kb的拷贝数变异(copy number variation, CNVs)片段进行致病性分析。根据最新版美国医学遗传学与基因组学学会(The American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)的序列变异解读指南[5]进行致病性分析解读。

1.2.3 MLPA的检测

DMD基因检测试剂盒(MRC-Holland,荷兰)含有2个探针(SALSA MLPA P034/P035),可检测DMD基因的79个外显子是否存在缺失或重复。使用ABI 3500DX测序仪(Thermo Fisher Scientific,美国)进行毛细管电泳，使用Coffalyser软件(http//www.mlpa.com)分析数据。以探针相对峰面积增加或减少30%分别提示DMD基因外显子的重复或缺失。

2、结果

2.1 aCGH及MLPA检测结果

所有羊水样本均无肉眼可见性母血污染，经STR检测，均无母体细胞污染，可用于后续检测。

羊水aCGH及MLPA检测结果提示：

胎儿1:男胎，arr[GRCh37]Xp21.1(31691172-31766673)×0(Xp21.1缺失75.5kb),MLPA提示DMD基因E52-53缺失，见图1。

胎儿2:男胎，arr[GRCh37]Xp21.2(31016983-31351900)×2(Xp21.2重复334.92kb),MLPA提示DMD基因E61-79重复，见图2。

胎儿3:女胎，arr[GRCh37]Xp21.2(31182699-31474949)×3(Xp21.2重复292.25kb),MLPA提示DMD基因E58-74重复，见图3。

胎儿4:男胎，arr[GRCh37]Xp21.1(31777925-32152126)×2(Xp21.1重复374.20kb),MLPA提示DMD基因E45-51重复，见图4。

4例孕妇外周血MLPA提示：孕妇1的DMD基因E52-53杂合缺失；孕妇2的DMD基因E61-79重复；孕妇3的DMD基因E58-74重复；孕妇4的DMD基因E45-51重复。4例胎儿的DMD基因变异均遗传自母亲。

图1胎儿1的aCGH和MLPA检测结果

图2胎儿2的aCGH和MLPA检测结果

图3胎儿3的aCGH和MLPA检测结果

图4胎儿4的aCGH和MLPA检测结果

2.2妊娠结局

经详细的遗传咨询和慎重考虑，孕妇1、孕妇2和孕妇4均选择终止妊娠；孕妇3选择继续妊娠，其女胎出生时表现出双腿向上弯曲，体毛浓密，新生儿疾病筛查未见异常，全外显子组测序(whole exome sequencing, WES)(随访时家属自述)未检测出DMD基因变异。4例胎儿的检测结果及妊娠结局见表1。

表1 4例胎儿检测结果及妊娠结局

3、讨论

目前，对DMD尚无有效治愈方法，该病对患者、家庭和社会均造成沉重负担。尽管学者们对DMD基因治疗进行了许多研究，如通读治疗、外显子跳跃治疗、载体介导的基因替代治疗和基因编辑治疗，但目前基因治疗仍然面临着巨大的挑战和困境[6]。因此在出生前及时发现并终止妊娠是避免DMD患儿出生及降低出生缺陷率的关键。女性DMD携带者一般无临床表型，无DMD家族史的患者尤其是新发病例通常无法在出生前被发现，因此产前DMD基因筛查尤为重要，产前诊断是预防DMD患者出生的重要手段。

3.1 aCGH技术在临床染色体疾病诊断中的应用

近年来，随着产前诊断技术的不断发展，aCGH作为新兴技术在临床染色体疾病诊断中逐渐得到了广泛的应用[7,8,9]。aCGH技术基于芯片平台，用不同荧光标记待测样本与标准基因组DNA对照，最后杂交于微阵列芯片上，可检测待测样本基因组相对于标准基因组DNA拷贝数的变化。它与传统的染色体G显带核型分析技术相比，具有分辨率高、覆盖面广、速度快和自动化程度高的优点，可大大提高产前诊断的准确性及疾病的检出率[10,11]。Costa等[12]研究表明，使用aCGH技术比单独使用常规核型分析的诊断率提高了4.9%。aCGH技术在产前诊断领域应用的临床指征主要有高龄、NIPT检测DNA高风险、夫妻一方染色体异常、B超提示异常、不良孕育史等[13]。本研究中4例胎儿均存在超声软指标异常，胎儿1为脐膨出，胎儿2为心血管结构异常，胎儿3为NF增厚伴血清学筛查临界风险，胎儿4为骶尾椎先天发育异常伴左侧侧脑室后角增宽。目前，以上异常与DMD基因的相关性均未见文献报道。产前超声软指标是产前诊断中不可忽视的一部分，超声软指标异常的出现意味着胎儿存在潜在的其他结构异常或染色体异常风险[14],且合并超声软指标异常数量越多的胎儿染色体异常发生率越高[15]。因此，对于胎儿超声软指标异常阳性时，有必要行介入性产前诊断，及时明确诊断可为产前咨询和后续临床处理提供依据[16]。aCGH技术应用于产前诊断可显著提高胎儿染色体异常的检出率，有效降低胎儿出生缺陷的发生[17]。

3.2 DMD的遗传咨询

虽然aCGH并非是DMD的特异性诊断技术，但在产前诊断过程中意外检出DMD基因或其他致病基因的微重复或微缺失的情况时有发生[18,19]。本研究通过aCGH技术进行了羊水产前诊断，意外发现了4例羊水样本的染色体Xp21.2或Xp21.1区域存在小片段的缺失或重复，该片段覆盖了DMD基因的外显子部分区域，同时MLPA检测证实了这些突变。这为aCGH技术对产前诊断的重要性再次提供了强有力的证据。李涛等[20]对64个DMD基因新发突变家系女性再妊娠进行产前诊断，结果发现胎儿中有2例存在DMD基因外显子缺失突变。本研究中4例孕妇均为DMD携带者，因此建议凡有DMD胎儿妊娠史的女性，即使本人DMD基因外显子未见变异，仍建议其再孕时及时进行DMD基因产前诊断。在本研究中，孕妇3的女性胎儿为DMD外显子重复携带者，但其出生后表现为双腿向上弯曲，体毛浓密，新生儿疾病筛查和WES未检测出明显异常，推测其双腿向上弯曲有可能是关节紧张，与宫内姿势有关；毛发的密度和颜色往往受父母遗传因素影响，先天性多毛症或一些内分泌疾病如先天性肾上腺皮质增生、垂体病变及卵巢病变也会引起体毛过重[21,22,23];因此认为其双腿和体毛的问题应该与DMD基因外显子重复无关。

综上所述，产前诊断是预防DMD患者出生的重要手段，aCGH技术用于产前诊断不仅可以检测染色体微缺失和微重复综合征，还有助于发现DMD或其他染色体片段缺失或重复所致的单基因疾病，在一定程度上降低了单基因疾病的漏诊率，为全面评估胎儿和后续的遗传咨询提供理论依据。

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