我国猪种资源丰富，约占世界猪种的三分之一[1],而且许多地方猪种具有繁殖性能高、耐粗饲和适应性强等优良特性[2]。随着外来猪种的不断引入，我国部分地方猪种面临灭绝或濒临灭绝，特别是2018年暴发的非洲猪瘟疫情，对地方猪种资源安全造成重大威胁。因此，加强地方猪种资源有效保护和开发利用，受到广泛关注。2019年农业农村管理司印发《国家级地方猪遗传材料采集保存工作实施方案》(农种畜函[2019]14号),委托科研院所采集地方猪种精液、体细胞等遗传材料进行冷冻技术处理，并纳入国家家畜基因库长期保存。

猪精液冷冻保存不仅是猪种资源保护的有效手段之一，而且在延长种公猪利用率、节约生产成本、降低猪场疫病生物安全风险、加快猪场疫病净化等方面均具有积极作用[3]。然而，猪精子对低温尤其敏感[4],导致了猪精液冷冻保存效果与生产应用推广还存在一定差距[5]。研究表明，精子在冷冻-解冻时会产生大量活性氧(ROS),是造成精子损伤的主要原因之一[6-7]。Garcez等[8]研究表明，冷冻时添加抗氧化剂能有效改善精子冷冻效果。

姜曲海猪具有高繁殖力、成熟早和耐粗饲等特性，是我国地方优良猪种之一，已被列入国家保护计划[9]。本研究以姜曲海猪精液为研究对象，在稀释液中添加甲磺酸米托醌(MitoQ),2,4-二硝基酚(DNP)和 4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-烃氧基(Tempol)3种不同抗氧化剂，以精子冷冻后的精子活力、顶体完整率、质膜完整率和体外受精卵裂率为指标筛选适合的抗氧化剂种类和添加浓度，同时观察筛选出的抗氧化剂对冷冻后精子超微结构变化的影响，为提高公猪精液超低温保存效果提供参考。

1、材料与方法

1.1 动物来源

健康、性成熟的姜曲海公猪由江苏姜曲海猪种业有限公司提供。

1.2 主要试剂

精液稀释液购于德国米尼图公司；异硫氰荧光素标记的花生凝集素(FITC-PNA)、碘化丙啶(PI),购于Sigma-Aldrich公司；2.5%戊二醛购于北京雷根生物技术有限公司；无特殊说明的所用试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 精液采集

借助于假阴道法采集公猪精液，颜色呈乳白色、无特殊气味、活力大于70%的精液符合试验要求。

1.4 溶液配制

稀释液：参考文献[10]方法配制基础稀释液，4 ℃保存不超过1周。

冷冻液和解冻液：参考文献[11]方法配制冷冻液Ⅰ液、冷冻Ⅱ液和解冻液，4 ℃保存不超过1周。

HEPES/BSA溶液：准确称量0.252 2 g果糖，0.759 9 g NaCl, 0.029 8 g KCl, 0.014 7 g CaCl2·2H2O,0.102 g MgCl2·6H2O,0.1 g BSA,0.238 3 g HEPES,置于100 mL蒸馏水中搅拌均匀，0.22 μm滤膜过滤，4 ℃保存，备用。

1.5 试验设计与精液处理

空白对照组为基础稀释液，3个试验组在基础稀释液中分别添加MitoQ、DNP或Tempol, 每种抗氧化剂均添加25、50 和100 μmol/L 3种浓度。

参考文献[11]方法。合格精液与稀释液1∶1.5混合，17 ℃冰箱过夜、离心；弃上清液，加入冷冻Ⅰ液(4 ℃,1.5 h);再加入等体积冷冻Ⅱ液(精液最终稀释比为1∶2),于4 ℃平衡后装入0.25 mL麦管(平衡及灌冲在45 min内完成);麦管于液氮面上3 cm处熏蒸10 min, 然后投入液氮罐提桶的纱布袋内保存。

解冻时，从液氮中迅速取出麦管后直接投入37 ℃水浴30 s, 再将其稀释于2 mL PBS,待检。

1.6 精子质量检测

1.6.1 精子活力

采用显微镜计数法评价精子活力[11]。精液样本稀释至1×107个/mL,取5 μL置于载玻片上，加盖玻片，相差显微镜下至少计200个精子。精子活力为直线运动精子所占百分率。

1.6.2 精子顶体完整率

采用FITC-PNA染色法评价精子顶体完整性[11]。精液经4 ℃预冷的丙酮固定5 min, HEPES/BSA封闭30 min, FITC-PNA孵育30 min, 离心弃去上清液，PBS洗涤沉淀后，取10 μL置于载玻片上，加盖玻片、封片，荧光显微镜下镜检。将精子顶体区发强绿色荧光者判定为顶体完整精子，计数完整精子顶体所占百分率。

1.6.3 精子质膜完整率

采用PI染色法评价精子质膜完整性[11]。将PI、HEPES/BSA和精液悬液以1∶50∶25混匀，37 ℃孵育30 min, 取10 μL置于载玻片上，加盖玻片、封片，荧光显微镜下镜检。将精子头部核区呈现红色荧光者判定为质膜损伤的精子，计数完整精子质膜的精子所占百分率。

1.6.4 精子体外受精卵裂率

参考文献[12]方法。抽吸法采集卵丘-卵母细胞复合体培养44 h, 获得成熟卵母细胞，经透明质酸酶部分脱卵丘细胞处理，以15枚为1组，置于改良Tris 缓冲液(mTBM)中，再向其中加入50 μL获能处理后的精液，精卵共同孵育6～8 h后转入100 μL胚胎培养液中培养，于显微镜下观察卵裂情况，计数卵裂胚胎所占百分率。

1.6.5 透射电镜观察精子结构

精子样本置于2.5%戊二醛，4 ℃条件下固定6 h; 4%琼脂包埋；再置于1%四氧化锇(OsO4)中二次固定1.5 h; 乙醇脱水后用环氧丙烷进行置换；环氧树脂812包埋、聚合、修块，半薄切片定位；然后重新包埋，超薄切片用醋酸双氧铀-柠檬酸铅进行染色，透射电子显微镜(TEM)下观察精子结构[11]。

1.7 数据统计与分析

采用SPSS统计软件的One-way ANOVA进行方差分析，Duncan's分析显著性水平。采用 GraphPad Prism 8.0软件作图。试验数据以“平均值±标准误”表示，P<0.05表示差异显著。

2、结果与分析

2.1 冷冻保存时间对精子冷冻质量的影响

未添加抗氧化剂处理的猪精液，超低温保存不同时间后进行解冻，精子的活力、顶体完整率、质膜完整率和体外受精卵裂率结果如图1所示。精子保存1周、1个月、3个月、6个月、9个月和12个月，各指标在不同时间之间无显著差异(P>0.05)。

图1 冷冻保存时间对冷冻猪精子质量的影响

2.2 稀释液添加不同抗氧剂对精子冷冻保存效果的影响

稀释液中添加3种不同浓度抗氧化剂，冷冻保存1周后对精子活力、顶体完整率、质膜完整率和体外受精卵裂率的影响见图2。

图2A显示，添加50 μmol/L MitoQ组精子的活力、顶体完整率和质膜完整率显著或极显著高于其他各组(P<0.05或P<0.01);图2B显示，添加50 μmol/L DNP组的精子质膜完整率极显著高于对照组(P<0.01),显著高于添加100 μmol/L DNP组(P<0.05);图2C显示，50 μmol/L Tempol组精子活力显著高于对照组和25 μmol/L Tempol组(P<0.05);50 μmol/L Tempol组的精子质膜完整率均显著高于对照组和100 μmol/L Tempol组(P<0.05)。综上，各抗氧化剂均以添加浓度50 μmol/L对精子冷冻具有较好保护效果，但体外受精卵裂率指标并未显示显著性优势。

图2 3种抗氧化剂不同浓度条件下保存1周对冷冻猪精子质量的影响

*表示差异显著(P<0.05),* *表示差异极显著(P<0.01)。下同。 A. MitoQ; B. DNP; C. Tempol。

添加50 μmol/L 3种不同氧化剂对冷冻猪精子质量的影响见图3,MitoQ组精子的活力、顶体完整率和质膜完整率(除DNP组)均显著或极显著高于其他各组(P<0.05或P<0.01)。

图3 3种不同氧化剂在50 μmol/L浓度条件下对冷冻猪精子质量的影响

综合图2和图3可见，稀释液中添加50 μmol/L MitoQ时，冷冻后精子的活力、顶体完整率、质膜完整率均显著优于DNP和Tempol各浓度。

2.3 稀释液添加MitoQ对冷冻精子超微结构的影响

对照组精子和稀释液中添加50 μmol/L MitoQ组精子冷冻1周后解冻，于TEM下观察超微结构(见图4)。

对照组精子冷冻后，细胞核染色质均匀，质膜膨胀，与顶体外膜间局部存在明显分离(图4A);尾部中段(横切面观)可见线粒体鞘、外周致密纤维、周围微管和中央微管，但线粒体较为模糊(图4B);尾部主段(纵切面观)可见外周致密纤维、周围微管和中央微管，但中央微管不清晰(图4C)。50 μmol/L MitoQ组冷冻精子细胞核染色质均匀，质膜与顶体间结合紧密，仅见局部质膜轻微膨胀(图4D);尾部中段(纵切面观)可见外周致密纤维、周围微管和中央微管排列整齐，线粒体呈串珠样紧密排列(图4E);尾部主段(横切面观)可见外周致密纤维、周围微管，中央微管清晰可见(图4F)。

图4 50 μmol/L MitoQ对冷冻-解冻精子超微结构的影响

A.精子质膜膨胀；B.精子尾部中段横切面，线粒体模糊；C.精子尾部主段纵切面，外周致密纤维和微管部分损伤；D.精子质膜轻微损伤；E.精子尾部中段纵切面，线粒体排列整齐，结构清晰；F.精子尾部主段横切面，外周致密纤维和微管结构完整、清晰。

3、讨论

精子活力是影响受精的主要因素，精子活力越高，受精过程越顺利，因此，精子活力是精液质量评价的重要指标之一[13]。精子顶体完整率、质膜完整率和体外受精卵裂率也与受精密切相关[14]。本研究结果表明，冷冻不同时间，各组间精子活力、顶体完整率、质膜完整率和体外受精卵裂率并无显著差异，冷冻精子的活力、顶体完整率、质膜完整率和体外受精卵裂率在12个月内不受冷冻保存时间的影响。说明，冷冻保存时间并不影响精子品质，可以达到长期冷冻保存目的。因此，本研究后续试验的精液样本冷冻保存时间为1周。

动物精子长期保存，可通过人工授精途径传播其优质的繁殖性能。许多研究表明，精子在冷冻过程中不可避免的会遭受物理损伤和化学损伤，影响精子的生育能力。与其他动物相比，猪精子质膜内胆固醇和磷脂的比值更低，更容易遭受低温损伤[14]。猪精子质膜中不饱和脂肪酸含量也较其他动物高，有氧代谢过程中更易被ROS攻击而发生脂质过氧化反应，这被认为是影响冷冻精子品质的重要原因之一，使用抗氧化剂和线粒体解偶联剂可有效降低冷冻过程中氧化应激对精子的损伤[15-16]。本试验选择3种抗氧化物质MitoQ、DNP和Tempol 添加于精液稀释液，探究其对冷冻姜曲海猪精子的保护作用。

MitoQ是辅酶Q衍生物，由内源性抗氧化剂辅酶Q10(CoQ10)和三苯基磷(TPP+)结合而成的化合物。作为线粒体靶向抗氧化剂，MitoQ在糖尿病、急性淋巴细胞白血病、肝损伤和中毒等氧化还原失调所致疾病中的积极调节作用已被证实[17],在对抗精液冷冻氧化损伤方面也具有积极作用[14,18]。本研究添加MitoQ对冻后猪精子品质的明显改善，可能是因为MitoQ兼具良好的亲脂性和亲水性，能穿过精子质膜并在线粒体中高浓度集聚，进而在线粒体局部发挥高效的抗氧化作用[19],降低氧化应激ROS造成的损伤。

DNP是一种化学弱酸质子解偶联剂，可诱导线粒体解偶联[20]。Fang等[18]发现，在冷冻介质中添加DNP,可降低猕猴和黄颡鱼解冻后精子的ROS水平和脂质过氧化反应，同时提高了冻后精子存活率。Don等[16]研究也表明，DNP有益于改善恒河猴精子冻后活力，虽所需的添加剂量在精液样本之间存在很大差异，但在无卵黄冷冻液中添加50 μmol/L DNP是必需的。本研究中，添加DNP有效改善了猪精子活力和质膜完整性，但对顶体完整率和体外受精卵裂率作用不显著，也可能与添加浓度的选择有关。DNP作为解偶联剂是否可阻止线粒体产生ROS进而有益于猪精液冷冻保存效果，还需进一步探索。

Tempol是一种超氧化物歧化酶类似物，具有膜穿透能力，可有效中和ROS。研究表明，冷冻液中添加5 μmol/L Tempol可保护精子免受氧化应激，提高解冻精子的活率、活力和DNA完整性[21]。10 ℃条件下保存羊驼精子时，添加1 μmol/L Tempol可增加其保存活力，减少DNA碎片[22]。在冷冻液中添加 10 μmol/L Tempol, 可提高公鸡精子冻后存活率，并能维持精子的活力、膜功能、线粒体活性和繁殖能力，降低公鸡精子细胞凋亡和脂质过氧化[23]。本研究中，添加50 μmol/L Tempol也可提高冻后姜曲海猪精子活力和质膜完整性。Tempol的这些作用可能是由于其具有细胞穿透性作用，可降低精子细胞内外超氧化物的生成能力。

虽然许多研究表明，添加抗氧化剂可提高精子冷冻保存效果，但也有研究报道，通过抗氧化剂将ROS水平过度降低到生理水平以下，可能会抑制精子活力[24]。本结果表明，在稀释液中添加不同浓度的MitoQ、DNP和Tempol, 对解冻猪精子的活力、顶体完整率和质膜完整率均有一定的改善作用，但以添加50 μmol/L MitoQ效果最好。另外，对添加50 μmol/L MitoQ解冻后精子进行超微结果观察，发现50 μmol/L MitoQ对精子质膜、线粒体结构和微管等均具有一定保护作用。本研究结果提示，MitoQ对猪精液超低温保存可能具有潜在优势，具有一定的开发应用价值。

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文章来源:王琳琳,李乐康,戴乾,等.稀释液添加不同抗氧化剂对冷冻姜曲海猪精子质量的影响[J].畜牧与兽医,2024,56(11):10-15.