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猪场断奶仔猪金黄色葡萄球菌和肠球菌分离鉴定耐药性分析

2024-11-13 115 上传者：管理员

摘要：为了解吉林省不同地区规模化生猪养殖场金黄色葡萄球菌和肠球菌的耐药情况，本试验对采自吉林省7个市(县)共20个规模化生猪养殖场的断奶仔猪粪便样本(420份)进行了金黄色葡萄球菌和肠球菌的分离鉴定和药物敏感性测定。结果显示，共分离到96株金黄色葡萄球菌和224株肠球菌，分离率分别为22.86%和53.33%。20种抗菌药物敏感性测定结果显示，猪源金黄色葡萄球菌对红霉素和四环素耐药最严重，耐药率均达到95.65%,对磷霉素敏感；猪源肠球菌对红霉素、复方新诺明、磺胺异噁唑、四环素、头孢他啶、多西环素和多黏菌素表现出高耐药率，耐药率均在90.00%以上，对磷霉素耐药率最低，仅为3.13%。多重耐药种数统计结果显示，金黄色葡萄球菌分离株至少耐3种抗菌药物，多重耐药种数在3～16种均有分布；肠球菌分离株至少耐5种抗菌药物，多重耐药种数在5～17种均有分布。结果表明，吉林省规模化猪场金黄色葡萄球菌和肠球菌均存在严重的多药耐药性，为吉林省金黄色葡萄球菌和肠球菌耐药情况和临床合理用药提供了参考依据。

关键词：
抗生素
断奶仔猪
耐药性
肠球菌
金黄色葡萄球菌
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由于抗生素在猪养殖业的广泛使用，猪源性金黄色葡萄球菌和肠球菌耐药性问题越发严重，引起了全球的广泛关注[1-2]。猪源金黄色葡萄球菌作为重要的人兽共患病原菌，可引起皮肤和组织感染、肺炎和细菌性贫血等疾病[3]。据已有研究报道，在健康的家畜(包括猪)中发现了与动物源性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Livestock-associated methicillin resistantStaphylococcus aureus,LA-MRSA),甚至出现了对已有抗生素耐受的“超级细菌”,给临床治疗带来困扰，也对牲畜接触者造成潜在风险[4]。除金黄色葡萄球菌之外，在兽医临床上国内外对肠球菌感染的研究也日益增多，感染猪的肠球菌主要是粪肠球菌和屎肠球菌[5-6]。据CHINET中国细菌耐药监测网(China Antimicrobial Surveillance Network)数据显示，中国细菌耐药性检测中多重耐药的肠球菌在临床并不少见[7]。肠球菌耐药性分为固有耐药性和获得性耐药性，对多种抗生素具有固有耐药的特点，给肠球菌感染的治疗带来挑战。

为了解吉林省不同地区规模化生猪养殖场内金黄色葡萄球菌和肠球菌的耐药现状，本试验对采自吉林省7个市(县)中的420份断奶仔猪粪便样本进行了金黄色葡萄球菌和肠球菌的分离鉴定和药物敏感性测定，以期为吉林省金黄色葡萄球菌和肠球菌耐药情况和临床合理用药提供参考依据。

1、材料与方法

1.1病料采集

2020年6—8月，从吉林省7个市(县)20个规模化生猪养殖场共采集断奶仔猪粪便样本420份，其中腹泻仔猪粪便样本360份，健康仔猪粪便样本60份。

1.2主要材料

无菌采样管(HBPT034-2)、无菌接种环、葡萄球菌选择性琼脂培养基、Pfizer肠球菌选择性琼脂培养基、胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptone soybean broth, TSB)培养基和琼脂糖，均购自青岛海博生物科技有限公司；Premix Tap酶(TaKaRa),购自长春海灵科贸有限公司；革兰染色试剂盒，购自珠海贝索生物科技有限公司；20种抗菌药物药敏纸片(青霉素、阿莫西林、氨苄西林、红霉素、四环素、强力霉素、头孢曲松钠、头孢西丁、头孢他啶、多黏菌素、磷霉素、复方新诺明、磺胺异噁唑、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星和氟苯尼考),均购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3主要仪器

正置显微镜(E100),尼康映像仪器销售(中国)有限公司产品；PCR基因扩增仪(LifeEco),杭州博日科技股份有限公司产品；核酸凝胶电泳仪(DYY-6C)和凝胶成像系统(WD-9413A),均为北京六一生物科技有限公司产品；微生物鉴定及药敏分析系统(AF-600/300),深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司产品。

1.4粪便样本处理及细菌分离和纯化

将粪便样本在新鲜TSB培养基中进行扩增培养后，使用无菌接种环蘸取扩增液，分别划线接种于葡萄球菌选择性琼脂培养基和肠球菌选择性琼脂培养基，放置37℃温箱培养18～24 h。待固体培养基上长出单菌落，使用无菌接种环挑取单菌落接种至TSB培养基中，放置37℃摇床培养18 h。取培养物进行革兰染色并在显微镜下进行镜检观察，并将细菌纯培养物进行保菌，冻于-20℃备用。

1.5猪源分离菌株16S rRNA测序鉴定和生化鉴定

使用煮沸裂解法[8]提取纯化后分离菌株的全基因组DNA,将DNA样本送生工生物工程(上海)股份有限公司进行16S rRNA测序，将测序结果在NCBI中进行BLAST比对，鉴定标准按照同源性≥97%判定。利用微生物鉴定及药敏分析系统进行菌株的生化鉴定。

1.6猪源金黄色葡萄球菌和肠球菌分离株药物敏感性测定

采用药敏纸片琼脂扩散法，即K-B (Kirby-Bauer)法[9]测定分离菌株对20种抗菌药物的敏感性。将金黄色葡萄球菌和肠球菌分离株在TSB培养基中培养至对数生长期(OD600 nm=0.8),取200μL菌液滴于TSB培养基上，使用无菌玻璃涂布棒均匀涂布菌液，待菌液晾干，将药敏纸片贴在涂布有菌液的TSB培养基上，放置37℃温箱培养18～24 h。测量各抗菌药物的抑菌圈直径大小，按照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)的判定标准[10]判定分离菌株对抗菌药物的敏感性。

2、结果

2.1猪源金黄色葡萄球菌和肠球菌分离和鉴定

通过16S rRNA测序鉴定和生化鉴定，从420份粪便样本中共分离鉴定出96株金黄色葡萄球菌和224株肠球菌(粪肠球菌168株，屎肠球菌56株),总阳性率分别为22.86%和53.33%;其中仅在腹泻粪便样本中分离出金黄色葡萄球菌；无论健康粪便样本还是腹泻粪便样本，均分离出肠球菌；除榆树市样本外，其他地区腹泻样本中肠球菌分离率均高于健康样本(表1)。

表1吉林省部分规模化生猪养殖场金黄色葡萄球菌和肠球菌的分离

2.2猪源金黄色葡萄球菌分离株药物敏感性测定

药物敏感性测定结果见表2和图1A,猪源金黄色葡萄球菌分离株对红霉素和四环素耐药率最高，均为95.65%;对链霉素、复方新诺明、氟苯尼考、青霉素、多西环素、诺氟沙星、氨苄西林和卡那霉素耐药率较高，分别为88.23%、84.78%、80.43%、80.43%、76.08%、73.52%、71.73%和63.04%;相比之下，金黄色葡萄球菌对阿莫西林、头孢曲松钠、头孢西丁和多黏菌素耐药率较低(20.58%～36.95%),未发现磷霉素耐药菌株。多重耐药种数统计结果显示，猪源金黄色葡萄球菌分离株至少耐3种抗菌药物，多重耐药种数在3～16种均有分布，多重耐药菌株中以耐10种(18.75%)抗菌药物为主，其次是14耐(16.67%)、12耐(10.42%)和6耐(10.42%)。

表2猪源金黄色葡萄球菌和肠球菌对抗菌药物的耐药率

2.3猪源肠球菌分离株药物敏感性测定

药物敏感性测定结果见表2和图1B,猪源肠球菌分离株对红霉素、复方新诺明、四环素、磺胺异噁唑、头孢他啶、多西环素和多黏菌素表现出高耐药率，分别为100%、98.95%、98.95%、97.91%、94.71%、91.66%和90.62%;对链霉素、卡那霉素、头孢曲松钠、环丙沙星、头孢西丁、庆大霉素、诺氟沙星、恩诺沙星和氟苯尼考耐药率较高，分别为88.54%、86.45%、75.00%、75.00%、70.83%、67.77%、61.45%、51.04%和46.87%;相比之下，肠球菌对氨苄西林、青霉素、阿莫西林和磷霉素耐药率较低，分别为38.54%、34.37%、11.45%和3.13%。多重耐药种数统计结果显示，猪源肠球菌分离株至少耐5种抗菌药物，多重耐药种数在5～17种均有分布，多重耐药菌株中以耐12种(16.07%)和13种(15.18%)抗菌药物为主，其次是14耐(12.5%)、15耐(12.5%)和11耐(10.71%)。

3、讨论

本试验结果表明，不同地区金黄色葡萄球菌分离率有所差别，且所有金黄色葡萄球菌分离于腹泻样本。从吉林市采集的60份健康猪源粪便样本中未分离到金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌总分离率为22.86%,远低于蔡建星等[11]报道的新疆地区猪源金黄色葡萄球菌的分离率(> 91%),这可能与养殖场饲养管理条件和环境等因素有关。在本试验中，相对于健康粪便样本，腹泻粪便样本中金黄色葡萄球菌的高分离率，提示金黄色葡萄球菌可能在仔猪腹泻中具有重要的作用，应在仔猪腹泻防控中予以高度重视。本试验药物敏感性结果显示，猪源金黄色葡萄球菌对红霉素和四环素耐药率最严重，达到95.65%,对链霉素、复方新诺明、氟苯尼考和青霉素耐药率均超过80.00%,这与梁荣等[12]对广东省猪源葡萄球菌耐药性分析结果以及Li等[13]对我国各地区猪源金黄色葡萄球菌耐药性分析结果一致，而红霉素和四环素等是我国兽医临床常用抗菌药物，进一步表明高水平的抗菌药物耐药性与抗菌药物使用的相关性。值得注意的是，猪源金黄色葡萄球菌表现出严重的多重耐药性，因此需要合理且有针对性的选择抗菌药物用于临床治疗，以免产生新的耐药菌株。

图1猪源金黄色葡萄球菌分离株(A)和肠球菌分离株(B)对抗菌药物的耐药率

与猪源金黄色葡萄球菌相比，猪源肠球菌的总分离率较高，达到53.33%,且无论健康粪便样本还是腹泻粪便样本，均能分离出肠球菌。与健康样本肠球菌分离率(30.00%)相比，腹泻样本分离率较高(57.22%),但分离率因样本来源地区不同而表现出差异性。在所有肠球菌分离株中，粪肠球菌分离率(40.00%)高于屎肠球菌分离率(13.33%),表明被检猪养殖场中主要分布粪肠球菌，其感染率较高，这与朱娜等[5]报道的湖南省猪源肠球菌分离结果存在差异，可能由于地理环境和分离方法的不同导致。本试验药物敏感性测定结果显示，健康样本和腹泻样本中肠球菌分离株的耐药性无明显差异，猪源肠球菌同样存在严重多药耐药性，耐药谱型更加广泛，最多可耐17种抗菌药物，对红霉素、复方新诺明、磺胺异噁唑、四环素、头孢他啶、多西环素和多黏菌素耐药率均超过90.00%,这些抗菌药物分别属于大环内酯类、四环素类、头孢类、多肽类和磺胺类，这可能由于这些养殖场多局限于使用相对固定的几类抗菌药物，未能根据细菌的耐药情况及时做出调整，长期如此使用抗菌药物导致多重耐药菌株的产生。由于肠球菌耐药性的不断严重，其致病性问题逐步凸显，应在动物细菌性感染的防控中高度关注。

综上，本试验结果显示，吉林省部分生猪养殖场金黄色葡萄球菌和肠球菌均表现出严重的多重耐药性，畜禽饲养中的减抗、限抗势在必行，任重道远。耐药性问题不紧事关畜禽健康养殖，也事关人类健康，耐药基因可通过环境、食物链传播给人类和其他动物。因此，金黄色葡萄球菌和肠球菌耐药调查需要引起持续关注，在畜禽饲养端禁止抗菌药物添加；在兽医临床的治疗端，要依据药敏试验结果，科学选用敏感的抗菌药物进行治疗。

参考文献:

[5]朱娜,方超,周成捷,等.湖南省猪源肠球菌的分离鉴定[J].湖南畜牧兽医,2016(2):41- 44.

[7]胡付品,郭燕,朱德妹,等.2017年CHINET中国细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志,2018,18(3):241- 251.

[8]夏乐先,孙文娟,沈振,等.煮沸裂解法和试剂盒法提取浸矿菌基因组DNA的比较[J].现代生物医学进展,2014,14(1):31- 35.

[9]关红,赵俊利,赵红霞,等.内蒙古地区奶牛源沙门氏菌的分离､鉴定及其对小鼠的致病性研究[J].中国畜牧兽医,2014,41(6):224- 229.

[11]蔡建星,郭庆勇,刘英玉,等.夏､冬两季猪源葡萄球菌耐药情况比较[J].中国畜牧兽医,2017,44(5):1541- 1546.

[12]梁荣,李伟,刘畅,等.广东省猪源葡萄球菌耐药性分析及多重耐药基因cfr的流行现状[J].中国兽医科学,2020,50(3):366- 372.

基金资助:国家自然科学基金(U19A2038,32072824,31872505);

文章来源:冀亚路,姜秋杰,袭恒豫,等.吉林省规模化猪场断奶仔猪金黄色葡萄球菌和肠球菌的分离鉴定和耐药性分析[J].中国兽医杂志,2024,60(11):40-45.