猪人工授精是一种重要的生猪养殖生产技术，而精液冷冻技术可长期保存具有优良经济性状与生物学性状的优良公猪精液[1],对建立公猪种质资源库和精液长途运输具有重要意义。

猪精液中精清含量较多[2],在冷冻降温过程中易形成体积较大的冰晶，造成精子脱水和刺伤细胞；加之精清中果糖、山梨醇等糖类物质含量较低[3],易造成降温过程中的冷休克。因此，猪冷冻精液无法用于大规模商品化生产。

目前，猪冻精生产技术中主要利用添加鸡卵黄来防止精子冷休克。卵黄中含有丰富的卵磷脂，低温不易冻结，因此加入卵黄后可防止精液产生冷休克[4]。但鸡卵黄中Ca2+含量过高，可能造成精子解冻后的提前获能和体外顶体反应[5],降低顶体完整率和受精质量。

在猪冻精生产过程中，主要利用甘油作为抗冻物质[6],甘油可自由进入精子细胞，冷冻过程中降低水的凝固点，从而减少冰晶对精子的物理损伤；同时调节细胞内外渗透压，减轻细胞脱水，以增强精子抗冻能力[7]。精液中添加甘油后一般需在5 ℃条件下静置一段时间[8],使甘油充分渗透进精子内，以达到抗冻保护作用[9]。但过高的甘油浓度和过长的平衡时间会造成精液解冻过程中渗透压的剧烈变化并对精子产生化学毒害作用[10]。

试验从卵黄种类、甘油加入后的平衡时间和解冻后离心重悬三个方面进行不同方式处理，并对不同方式处理的冻精在解冻后0小时和3小时分别进行精子活力、畸形率、顶体完整率等指标检测，选择最优的冷冻生产流程，以提高猪冷冻精液的品质，旨在为猪精液冷冻保存技术的发展提供一定的基础数据。

1、材料

1.1 精液

成年、体质健康、性欲旺盛、采精频率正常约克夏公猪的中段精液100 mL,由河南精旺猪种改良有限公司提供。

1.2 主要试剂

葡萄糖、柠檬酸钠、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、三羟甲基甲胺基乙磺酸(TES)、碳酸氢钠、半胱氨酸、甘油、十二烷基磺酸钠(SDS)等，均购自国药集团化学试剂有限公司；新鲜鸡卵黄和新鲜鹅卵黄，均由河南谊发牧业有限公司提供。

1.3 主要仪器

全套冻精生产设备、精液质量检测分析系统、17 ℃/5 ℃平衡柜，均购自德国米尼图公司；低速冷冻离心机，购自安徽中科中佳科学仪器有限公司；相差显微镜，购自迈时迪科技有限公司；一次性精子计数板，购自荷兰LEJA公司；移液枪，购自德国普兰德公司；离心废液抽吸泵、水浴锅，均购自群安科学仪器(浙江)有限公司；冷冻仪，购自德国米尼图公司。

2、方法

2.1 试验分组及处理

具体见表1。

表1试验分组及处理

2.2 稀释液的配制

按照《猪冷冻精液生产技术规范》和《动物繁殖学》[11]中的制备方法配制冻精试剂：取葡萄糖26 g, 柠檬酸钠6 g, Tris 5 g, 柠檬酸3.4 g, EDTA-2Na 3 g, TES 2.5 g, 碳酸氢钠1.5 g, 半胱氨酸0.1 g, 以超纯水定容至1 000 mL作为基础液；取部分基础液作为预稀释液和解冻液，另取部分基础液缓慢多次按照77∶20体积比分别加入鸡卵黄或鹅卵黄，混匀后作为冷藏液A(鸡卵黄)和冷藏液B(鹅卵黄),置17 ℃平衡柜中保存，备用。取部分冷藏液A和B分别与甘油、SDS按照95∶4.3∶0.7体积比混匀作为冷冻液A和冷冻液B,置5 ℃平衡柜中备用。

2.3 原精液的检测

将采集的100 mL精液翻转摇匀，抽取适量精液注入一次性精子计数板中并制作姬姆萨染色标本，利用精液质量检测分析系统和相差显微镜检测原精液精子活力、畸形率、密度、顶体完整率等指标，原精液质量检测结果见表2。

表2原精液质量指标

2.4 细管冷冻精液的制作与检测

2.4.1 预稀释液的添加

按照1.5∶1的比例将与精液等温的预稀释液加入8组精液中，将稀释后的精液于室温(20 ℃)静置2 h, 转入17 ℃平衡柜中平衡4 h, 使精液缓慢降温至17 ℃。

2.4.2 离心

提前2 h将低速冷冻离心机及操作间室温调到17 ℃,使环境温度一致。精液充分平衡后摇匀，防止精子假死，17 ℃、900×g离心15 min, 用离心废液抽吸泵去除上清液。

2.4.3 冷藏液的添加及平衡

用17 ℃的冷藏液A稀释离心后的第1组、第2组、第组3和第4组精液，冷藏液B稀释离心后的第5组、第6组、第7组和第8组精液，充分混匀，使精子密度达到约2.0×109个/mL。将稀释后的精液放入5 ℃平衡柜中平衡4 h, 使精液缓慢冷却至5 ℃。

2.4.4 冷冻液的添加及灌装

在5 ℃平衡柜中按照1∶1比例用冷冻液稀释精液，将冷冻液A加到第1组、第2组、第3组和第4组精液中，冷冻液B加到第5组、第6组、第7组和第8组精液中，使稀释后的精液密度达到约1.0×109个/mL精子数。

稀释混匀后，尽快在5 ℃平衡柜中用细管灌装机(使用前在5 ℃平衡柜中充分稳定、平衡)对第1组、第2组、第5组和第6组精液进行0.5 mL细管分装及封口操作，并在细管托架上码好；第3组、第4组、第7组和第8组精液在5 ℃平衡柜中静置2 h后进行0.5 mL细管分装及封口操作，并在细管托架上码好。

2.4.5 细管在冷冻仪中的冷冻

灌装的同时打开冷冻仪配置的液氮压力罐，选定冷冻程序待命。灌装后迅速将码好的细管样品放入冷冻仪中进行冷冻，同时用泡沫箱准备散装液氮。待程序结束后，迅速取出细管样品浸入散装液氮中，该过程中液氮泡沫箱要加盖密封。

2.4.6 冷冻细管的解冻及检测

提前将两台水浴锅温度分别设置为38 ℃和50 ℃进行预热，并将配好的解冻液放入38 ℃水浴锅中备用。

从液氮箱中取出第1组、第3组、第5组和第7组细管样品快速置于50 ℃水浴锅中解冻20 s; 取出细管擦干并剪去一端，将精液移入10 mL离心管中，用预热的解冻液稀释至5 mL。

再从液氮泡沫箱中取出第2组、第4组、第6组和第8组细管样品快速置于50 ℃水浴锅中解冻20 s; 取出擦干细管并剪去一端，将精液移入10 mL离心管中，用预热的解冻液稀释至5 mL,擦干离心管放入离心机中，17 ℃、900×g离心15 min; 弃去上清液，加入预热的解冻液至5 mL进行重悬。抽取适量样品注入精子计数板并同时制作姬姆萨染色标本，利用精液质量检测分析系统和相差显微镜检测各组冻精解冻后的精子活力、畸形率、顶体完整率等指标，比较离心重悬对精子质量的影响。

将各组样品在17 ℃平衡柜中静置3 h后取出摇匀，抽取适量注入精子计数板并同时制作姬姆萨染色标本，利用精液质量检测分析系统和相差显微镜检测各组冻精解冻后的精子活力、畸形率、顶体完整率等指标，比较不同静置时间对精子质量的影响。

2.5 数据的统计分析

采用Excel及SPSS 22.0软件整理试验数据，结果以“平均值±标准误”表示，采用F检验对试验结果进行差异显著性分析，P<0.05 表示差异显著，P>0.05 表示差异不显著。

3、结果与分析

结果见表3和表4。

3.1 不同种类卵黄对猪冻精解冻后质量的影响

解冻后0小时测定结果显示：在精子活力方面，第5组与第1组、第6组与第2组、第7组与第3组、第8组与第4组相比均显著提高(P<0.05);在精子畸形率方面，第5组与第1组相比差异不显著(P>0.05),第6组与第2组、第7组与第3组、第8组与第4组相比均显著降低(P<0.05);在顶体完整率方面，第5组与第1组、第6组与第2组、第7组与第3组、第8组与第4组相比均差异不显著(P>0.05)。

解冻后3 小时测定结果显示：在精子活力方面，第5组与第1组、第6组与第2组、第7组与第3组相比均差异不显著(P>0.05),第8组与第4组相比显著下降(P<0.05);在精子畸形率方面，第5组与第1组、第6组与第2组、第8组与第4组相比均显著降低(P<0.05),第7组与第3组相比差异不显著(P>0.05);在顶体完整率方面，第5组与第1组、第6组与第2组、第7组与第3组、第8组与第4组相比均差异不显著(P>0.05)。

以上结果表明，在加入冷冻液后是否平衡和解冻后是否离心重悬等条件相同的情况下，使用鹅蛋卵黄作为防冷刺激物质相较于鸡蛋卵黄解冻后精液质量有所提高。

表3不同卵黄、平衡时间及去甘油方式对猪冷冻精液品质的影响(解冻后0小时测定)

表4不同卵黄、平衡时间及去甘油方式对猪冷冻精液品质的影响(解冻后3小时测定)

3.2 添加甘油后不同平衡时间对猪冻精解冻后质量的影响

解冻后0小时测定结果显示：在精子活力方面，第8组与第6组相比显著降低(P<0.05),第3组与第1组、第4组与第2组、第7组与第5组相比均差异不显著(P>0.05);在精子畸形率方面，第3组与第1组、第4组与第2组、第8组与第6组相比均显著提高(P<0.05),第7组与第5组相比差异不显著(P>0.05);在顶体完整率方面，第3组与第1组、第4组与第2组、第7组与第5组、第8组与第6组相比均差异不显著(P>0.05)。

解冻后3小时测定结果显示：在精子活力方面，第4组与第2组相比显著提高(P<0.05),第3组与第1组、第7组与第5组相比均显著降低(P<0.05),第8组与第6组相比差异不显著(P>0.05);在精子畸形率方面，第3组与第1组、第4组与第2组、第8组与第6组相比均差异不显著(P>0.05),第7组与第5组相比显著提高(P<0.05);在顶体完整率方面，第4组与第2组相比显著提高(P<0.05),第3组与第1组、第7组与第5组、第8组与第6组相比均差异不显著(P>0.05)。

结果显示，在其他条件相同情况下，添加甘油后在5 ℃环境下平衡2 h进行灌装冷冻相比于直接灌装冷冻解冻后精液质量在0小时测定的结果差别不大，但解冻后3小时测定的结果下降幅度增大。

3.3 解冻后离心重悬对猪冻精解冻后质量的影响

解冻后0小时测定结果显示：在精子活力方面，第2组与第1组、第4组与第3组、第6组与第5组、第8组与第7组相比均显著降低(P<0.05);在精子畸形率方面，第2组与第1组、第4组与第3组、第6组与第5组、第8组与第7组相比均显著提高(P<0.05);在顶体完整率方面，第2组与第1组、第4组与第3组、第8组与第7组相比均显著降低(P<0.05),第6组与第5组相比差异不显著(P>0.05)。

解冻后3小时测定结果显示：在精子活力方面，第2组与第1组、第6组与第5组、第8组与第7组相比均显著降低(P<0.05),第4组与第3组相比差异不显著(P>0.05);在精子畸形率方面，第2组与第1组、第4组与第3组、第6组与第5组、第8组与第7组相比均显著提高(P<0.05);在顶体完整率方面，第2组与第1组、第6组与第5组、第8组与第7组相比均显著降低(P<0.05),第4组与第3组相比差异不显著(P>0.05)。

本试验通过解冻后离心重悬的方式去除部分猪冷冻精液中含有的甘油，目的在于降低甘油对精子活力的不良影响。但在其他条件相同情况下，猪冷冻精液解冻后离心重悬质量明显下降。

4、讨论与结论

猪精子与其他畜禽精子相比，对外界环境温度的改变更敏感。在猪冷冻精液制作过程中冰结晶是造成精子死亡的主要原因。冰晶首先在精清和稀释液中开始形成，使尚未结晶的液体中的溶质浓度增加，形成高渗溶液，导致精子细胞膜内外渗透压不平衡；同时冰晶体积不断增大，对精子造成机械损伤。本试验结果显示：在猪冻精生产过程中使用鹅卵黄作为防冷刺激物质时的精液质量要优于使用鸡卵黄；添加甘油后在5 ℃环境下平衡2 h进行灌装冷冻相比于直接灌装冷冻，解冻后精液质量随存放时间延长下降幅度增大；解冻后离心重悬可造成精液质量严重下降，这种去甘油的方法可能不适合用于猪冷冻精液的生产。

精子的活力、畸形率和顶体完整率直接影响着精子的受精能力，是评定猪冷冻精液解冻后质量及能否用于人工授精的重要指标。综合来看，试验中第5组与第7组冷冻精液解冻后的质量要高于其他组别，两组均使用了鹅卵黄；但第7组相较于第5组随着解冻后放置时间的延长精液质量下降较快，可能是加入含甘油的冷冻液后在5 ℃环境下平衡2 h使甘油对精子产生了较大的化学毒害作用。因本试验使用的冷冻稀释液中甘油浓度为4.3%,与其他研究相比浓度略偏高，有可能是过高的甘油浓度本身对精子产生了一定的毒害作用，致使解冻后精液质量随着保存时间的延长快速下降，因此在冷冻稀释液中添加较低浓度(2%～3%)的甘油解冻后保存效果会更好。

综上所述，使用鹅卵黄并在添加甘油后立即进行灌装冷冻的方式更适合生产猪冷冻精液，其原因可能是正常精子在受精前需要与精清中的去能因子分离并接触雌性生殖道的获能因子才能获得受精能力，且在Ca2+含量较高的环境中会出现尾部鞭打频率增加、运动速度加快等超激活现象并迅速发生顶体反应。研究发现，鹅卵黄的Ca2+含量约为13 mg/100 g, 相较鸡卵黄(112 mg/100 g)要低很多，比较接近猪精液中Ca2+含量(约为6 mg/100 g),较低的Ca2+含量可能会降低解冻后提前获能和体外顶体反应的精子数量。另外，鹅卵黄较鸡卵黄的黏稠度高，可提高解冻后精液的均质程度和稳定性；且较高的黏稠度也可能造成甘油无法顺利进出细胞膜，使甘油产生的化学毒害作用降低。但甘油在精子质膜内外浓度差的增大也可能会使精子在冷冻过程中细胞内部电解质浓度过高，使原生质变干并失去酸碱平衡，造成不可逆的变化；同时细胞内部冰晶形成量增加，对精子膜和细胞器产生更多的物理压力和刺伤，破坏精子结构，导致精子死亡。

本试验还观察到，解冻后静置3 h大部分精子已经自然沉降，精液质量下降幅度较大，结合解冻后离心重悬精液质量同样明显下降，可见冻精解冻后精子沉降造成的伤害可能是精液品质下降的重要因素。如何避免猪冷冻精液解冻后精子的沉降还需进一步研究。本试验结果为猪精液冷冻保存技术研究提供了依据。

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基金资助:鹤壁职业技术学院2023年度校本科研课题(2023-KJZD-008);

文章来源:张帆,原慧.不同卵黄种类及甘油处理方式对猪冷冻精液品质的影响[J].黑龙江畜牧兽医,2024,(21):46-50.