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PRRSV GP2-GP4融合蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

2024-08-22 94 上传者：管理员

摘要：猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是危害养猪业发展的重要病原之一，由于其结构蛋白GP2与GP4以复合物的形式与靶细胞的CD163受体结合，同时可参与病毒中和反应，因此开展GP2与GP4蛋白研究对PRRSV疫苗研发具有重要意义。该研究将GP2和GP4基因通过柔性肽连接，克隆至原核表达载体pET32a中，并通过大肠杆菌表达系统成功表达GP2-GP4融合蛋白，目的蛋白以包涵体形式表达，经纯化及复性后获得高纯度的GP2-GP4融合蛋白，通过免疫兔制备多克隆抗体。SDS-PAGE结果显示，目的蛋白大小约55 kDa，与预期一致；ELISA结果显示，多克隆抗体效价达到1∶64 000;Westernblot与IFA结果表明，多克隆抗体能与GP2-GP4蛋白产生特异性反应，具有良好的反应原性。该研究实现了PRRSV GP2-GP4蛋白的融合表达，并以此为基础制备了特异性良好的多克隆抗体，为探讨PRRSV GP2-GP4蛋白功能及后续疫苗研究奠定了基础。

关键词：
养猪业
原核表达
多克隆抗体
猪繁殖与呼吸综合征
糖蛋白
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猪繁殖与呼吸综合征病毒于20世纪80年代最初出现在美国和欧洲，目前在我国呈地方性流行现象，作为影响养猪业最严重的传染病之一，给我国养猪行业带来巨大的经济损失[1]。PRRSV属于动脉炎病毒科、动脉炎病毒属的成员，是具有衣壳的单股正链RNA病毒，有包膜[2]。病毒基因组RNA由核衣壳蛋白包装，在核衣壳周围，表面糖蛋白和膜蛋白插入脂质双层包膜中形成病毒粒子[3]。

PRRSV受体介导的病毒入侵已被广泛研究，迄今为止，有研究发现，富含半胱氨酸的清道夫受体家族成员CD163是PRRSV感染的关键因素[4]。CD163属于富含半胱氨酸清道夫受体超家族（SRCR-SF）的B类，其过表达会使得多种非允许细胞系对该病毒易感[5]。GP2和GP4是PRRSV的结构蛋白，为典型的Ⅰ型跨膜蛋白，经研究确定为病毒附着蛋白[6]。GP2和GP4能够通过与CD163相互作用形成二聚体从而参与PRRSV感染细胞的过程[7]。此外，GP2和GP4还能够参与病毒的中和反应。试验表明，用免疫共沉淀试验可检测到GP2和GP4可特异性与CD163相互作用，从而认为GP2和GP4蛋白可作为病毒粘附蛋白介导糖蛋白反应，在病毒感染细胞中可调节和CD163的反应[8]。

目前，国内外学者就PRRSV的分子流行病学、病原学、诊断学和预防学等方面进行了深入研究，获取了有关PRRSV的大量试验数据，这些研究成果对控制该病的流行起到了重要作用。然而，由于PRRSV的持续快速变异，灭活苗和弱毒活疫苗对此病预防效果难以满足生产实践需求[9]，基因工程亚单位苗是将来研究的重要方向。

本研究旨在利用大肠杆菌原核表达系统表达PRRSV GP2-GP4融合蛋白，并利用His标签进行蛋白纯化，通过免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，鉴定其免疫原性。制备的多克隆抗体可为蛋白的免疫原性积累数据和材料，为深入研究PRRSV GP2与GP4蛋白及后续基因工程亚单位疫苗研究奠定了基础。

1、材料与方法

1.1 主要试剂

PRRSV JXA1株，Marc145细胞，pET-32a质粒，大肠杆菌感受态BL21(DE3）、DH5α由本实验室保存；GP2-GP4基因由生工生物工程（武汉）有限公司合成；HRP标记的羊抗鼠IgG抗体和小鼠抗His标签的抗体购自美国Abbkine公司；新西兰大白兔购自湖南太平生物有限公司。

1.2 引物设计与重组质粒的构建

从GenBank数据库获取PRRSV GP2与GP4基因序列（GeneBank:MW460545.1），将GP2和GP4通过柔性连接肽（GGGGS）串联得到融合序列，命名为GP2-GP4，由生工生物工程（武汉）有限公司合成，大小为1071 bp。使用Primer 5软件设计引物PRRSV GP2-GP4-F,PRRSV GP2-GP4-R，具体引物信息：PRRSV GP2-GP4-F:5’-CGGGATCCATGTCACCA TCACCA-3’;PRRSV GP2-GP4-R:5’-GACGTCGACTTA ATGATGATGATGG-3’（其中加粗碱基为保护碱基，下划线为限制性内切酶序列）。用引物PRRSV GP2-GP4-F、PRRSV GP2-GP4-R通过PCR扩增后将目的基因胶回收，空载与目的片段分别用限制性内切酶（BamHⅠ和SalⅠ）双酶切，用T4连接酶将两者连接过夜，连接产物转化至DH5α感受态细胞筛选阳性质粒进一步测序，将测序正确的质粒命名为pET-32a-GP2-GP4。

1.3 重组蛋白的表达形式鉴定

将重组质粒转化到BL21(DE3）感受态细胞，筛选阳性菌落进行培养，当OD6 0 0值处于0.4～0.6，收集未诱导菌液作为阴性对照，剩余菌液作为试验组加入0.5 mmol/L IPTG，诱导表达5 h后离心收集菌液，加入PBS清洗1遍后，在超声波破碎仪下超声破碎处理，收集总蛋白后4℃离心，分别对总蛋白及离心后的上清和沉淀制样，沉淀即为包涵体用8 mol/L尿素溶解。分别取未诱导和诱导后的总蛋白、上清液和包涵体进行SDS-PAGE鉴定。

1.4 重组蛋白的纯化及复性

将大量诱导表达后的蛋白用0.45μm的滤膜过滤，采用镍柱亲和层析纯化技术对目的蛋白进行纯化，即将蛋白加入到平衡后的镍柱结合一段时间，用不同咪唑浓度的Elution buffer进行洗脱，将收集到的液体进行SDS-PAGE验证。将纯化后的蛋白依次用6、4、2、1 mol/L尿素对其进行梯度复性。

1.5 多克隆抗体的制备

将复性后的蛋白与弗氏完全佐剂以1∶1的比例混合，使用鲁尔接头和5 mL注射器将混合物进行乳化，采用背部多点注射的方式对兔进行免疫。初免后14、28 d，用弗氏不完全佐剂按照相同方法进行乳化对其加强免疫。在第3次免疫7 d后对兔子进行心脏采血，收集血清。

1.6 多克隆抗体的效价测定

采用间接ELISA方法测定抗体效价。用GP2-GP4重组蛋白包被ELISA板，用PBS倍比稀释（1∶500～1∶64 000）后的多克隆抗体作为一抗，HRP标记的山羊抗家兔IgG作为二抗进行ELISA测定。将抗原包被至96孔ELISA板4℃过夜（12～16 h),37℃封闭1 h，一抗37℃孵育30 min，二抗37℃孵育30 min,TMB显色15 min,H2SO4终止反应，酶标仪检测OD600值。

1.7 多克隆抗体Western blot验证

将GP2-GP4蛋白经蛋白胶SDS-PAGE电泳后，将其转印至PVDF膜上。加入能够完全覆盖PVDF膜的封闭液置于摇床封闭处理3 h（室温）。以兔血清，即本试验所制备的多克隆抗体为一抗对PVDF膜进行过夜孵育（4℃）。PBST洗涤，加入二抗，摇床孵育45 min（室温）。PBST洗涤，最后进行增强化学发光（ECL）显色反应曝光。

1.8 多克隆抗体IFA验证

将Marc-145细胞接种于24孔细胞培养板，待细胞长至80%时，用PRRSV JXA1株感染Marc-145细胞，同时设置未感染组作为对照组。感染72 h后，弃去培养基，PBST洗4遍；加入4%多聚甲醛室温固定30 min,PBST洗4遍；加入5%BSA 37℃封闭50 min；加入封闭液稀释的兔多克隆抗体（1∶500稀释）37℃孵育1 h,PBST洗5遍；加入FITC标记的山羊抗兔二抗（1∶500稀释）3 7℃避光孵育1 h,PBST洗5遍；加入DAPI室温孵育5 min,PBST洗4遍，置于荧光显微镜下观察。

2、结果

2.1 目的基因的扩增

PCR产物经10 g/L琼脂核酸凝胶电泳试验成像后结果显示，见图1。目的基因大小为1 071 bp，与预期基因大小一致。

图1 PCR扩增结果

2.2 重组质粒的菌液PCR及双酶切验证

将构建的重组质粒pET-32a-GP2-GP4进行菌液PCR成功鉴定阳性菌落，见图2。提取质粒进行双酶切鉴定，得到大小约5 900 bp的载体和约1 100 bp的目的基因，见图3。将重组质粒取10μL至生工生物工程（长沙）有限公司进行测序，结果表明GP2-GP4被成功插入pET-32a，重组质粒构建成功。

图2 重组质粒pET32a-GP2-GP4菌液PCR结果

图3 重组质粒酶切鉴定

2.3 重组蛋白的表达及纯化

诱导表达后的重组菌超声破碎后，分别取总蛋白、上清液和包涵体制备样品进行SDS-PAGE分析。结果可见，融合蛋白约为55 kDa，见图4，以包涵体的形式成功表达。用不同浓度咪唑的洗脱液进行洗脱，结果见图5，在500 mmol/L咪唑洗脱液样品中目的蛋白含量及纯度较高。

图4 GP2-GP4蛋白的表达鉴定

图5 纯化的GP2-GP4蛋白的SDS-PAGE分析

2.4 多克隆抗体效价测定

经过ELISA测定，在GP2-GP4蛋白包被浓度为1 0μg/mL时，血清以1∶64 000稀释时，P/N值大于2.1，确定该血清的抗体效价为1∶64 000。

2.5 多克隆抗体的Western Blot验证

以GP2-GP4蛋白作为抗原，制备的多抗为一抗进行Western Blot验证，结果显示，见图6。在约55 kDa处有明显的条带，与预期一致，说明所获的GP2-GP4蛋白具有良好的免疫原性，所制备的多克隆抗体可特异性识别GP2-GP4蛋白。

图6 家兔抗GP2-GP4多克隆抗体的Western Blot鉴定

2.6 多克隆抗体的IFA验证

将PRRSV感染Marc-145细胞48 h进行固定，以兔多克隆抗体为一抗，FITC标记的山羊抗兔IgG为二抗进行IFA验证，结果见图7。PRRSV组感染的Marc-145细胞显示绿色荧光，且对照组未显示荧光，说明制备的多抗能与GP2-GP4蛋白产生特异性反应。

图7 家兔抗GP2-GP4多克隆抗体的IFA鉴定（100×）

3、讨论

PRRSV对于仔猪、妊娠母猪的危害极大[10]，对各个阶段的猪均有不同程度的影响[11]，如导致育肥猪生长速度慢、母猪繁殖效率降低、公猪精子质量差等[12]。该病的特征是母猪突然的流产和不育，产下虚弱或死亡的仔猪，仔猪则会出现呼吸窘迫、发热、间质性肺炎等症状，其断奶前死亡率也会增加[13]。

PRRSV主要感染猪单核细胞与巨噬细胞，因其自身基因组特性及各种内外因素的影响，从而一直持续变异产生新的毒株，给防控带来了巨大的挑战。灭活疫苗和弱毒疫苗等传统疫苗现如今无法满足PRRS的防控需求[14]，新型疫苗在PRRS的防控中拥有极大的潜力。亚单位疫苗以纯化后的特定病原体蛋白组分构建而成，相较于全病原体疫苗，其安全性更可控。多种研究表明，亚单位疫苗并无病毒感染成分，安全可靠且适合规模化生产，如今被认为是研发多种病毒疫苗的最佳候选者之一，Oh T等[15]研究证实了亚单位疫苗对PRRS有着出乎意料的效果。

宿主细胞表面的CD163蛋白具有介导病原体内吞的作用，有研究开发了针对PAM CD163受体的单克隆抗体（mAb），使GP2不能与CD163结合，从而部分阻断PRRSV进入细胞，表明PRRSV GP2在介导PRRSV进入靶细细胞时具有积极作用。GP4蛋白少量存在于PRRSV表面，是PRRSV的关键蛋白且能够被宿主细胞的抗体识别诱发免疫反应[16]。更重要的是，PRRSV的结构蛋白GP2和GP4可协同作用在病毒囊膜表面的形成异源多聚体位复合物。GP2和GP4已被证明与CD163受体相互作用，是细胞培养中病毒嗜性的主要决定因素[17]。故GP2与GP4成为PRRSV疫苗研发的重点其一。

人工制备的抗体通常由多克隆抗体和单克隆抗体组成。与单克隆抗体相比，多克隆抗体显示多表位结合特性，使其理想地适用于许多应用。相比于单克隆抗体，多克隆抗体生物物理多样性通常更容易储存和稀释，其制备方法简单、廉价易得且周期短[18]。蛋白抗原是多抗制备的第一步，目前蛋白表达使用最广泛的时大肠杆菌原核表达系统，其相较于真核表达系统蛋白表达量过低、成本高等一系列缺点，原核表达系统具有众多优点，如表达量高、成本低、易于纯化、便于工业化生产等[19]。

4、小结

本研究通过原核表达系统构建了重组表达质粒pET32a-GP2-GP4，成功表达并纯化获得GP2-GP4蛋白，免疫新西兰大白兔，3次免疫程序完毕后采血分离血清成功获得了多克隆抗体。经Western blot与IFA验证此抗体可特异性识别GP2-GP4抗原。本研究所制备的GP2-GP4多抗可为之后研究GP2-GP4相关的试验及PRRSV后续疫苗研究奠定了基础。

参考文献:

[10]李少丽,尹忠良,张春阳,等.猪繁殖与呼吸综合征二价灭活疫苗的免疫效力研究[J].现代畜牧兽医,2021(11):55-58.

基金资助:云南省重大科技专项计划(202202AE090032);

文章来源:宁慧敏,彭娜娜,陈玉豪,等.PRRSV GP2-GP4融合蛋白原核表达及多克隆抗体的制备[J].现代畜牧科技,2024,(08):22-26.