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辣椒碱对脂多糖攻毒仔猪肠道抗氧化功能的影响

2024-11-08 87 上传者：管理员

摘要：旨在研究日粮添加辣椒碱(CAP)对脂多糖(LPS)攻毒仔猪肠道抗氧化功能的影响。选取初始体重相近的28日龄断奶仔猪24头，随机分为3组，对照组(CON)和LPS组饲喂基础日粮，LCA组在基础日粮中添加800 mg/kg的CAP,试验周期35 d; LPS组和LCA组仔猪于采样前4 h按照100μg/kg体重的剂量腹腔注射LPS,CON组仔猪腹腔注射等剂量的生理盐水。结果显示：与CON组相比，LPS攻毒仔猪空肠总抗氧化能力(T-AOC)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量显著下降(P<0.05),8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量显著升高(P<0.05),回肠T-AOC和总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性以及GSH含量显著下降(P<0.05),丙二醛(MDA)含量显著升高(P<0.05);日粮中添加CAP可显著提高LPS攻毒仔猪空肠过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，降低8-OHdG含量(P<0.05),显著提高回肠T-SOD和GSH-Px活性(P<0.05);LPS攻毒导致仔猪空肠超氧化物歧化酶1(SOD1)的mRNA表达量显著下降(P<0.05);CAP可显著提高LPS攻毒仔猪空肠磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)和SOD1的mRNA表达量(P<0.05),以及回肠谷胱甘肽过氧化物酶1(GPx1)的mRNA表达量(P<0.05)。结论：日粮中添加CAP具有改善LPS攻毒仔猪肠道抗氧化功能的作用，其中空肠抗氧化功能的提高可能与激活PI3K/AKT/Nrf2信号通路有关。

关键词：
仔猪
抗氧化
肠道
脂多糖
辣椒碱
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在集约化养殖系统中，当仔猪和传染性病原体接触时容易受到免疫应激影响[1-2]。脂多糖(LPS)是一种在革兰阴性菌细胞壁中发现的物质，可以用来在动物模型中诱导免疫应激发生[3]。肠道不仅是营养物质消化吸收的主要场所，同时也起到抵御病原微生物入侵的屏障作用[4]。免疫应激导致仔猪生长性能下降、肠道通透性增加和肠道抗氧化功能受损[5-6],这给养猪行业带来了重大经济损失。先前的研究表明，免疫应激与活性氧积累诱导氧化应激发生进而驱动核因子κB抑制蛋白降解有关[7-8]。植物提取物可以作为天然抗氧化剂添加于日粮，从而提高动物抗氧化功能[9]。因此，可以通过调控营养途径改善免疫应激对仔猪肠道抗氧化功能的影响。

辣椒碱类物质主要包括5种成分，其中辣椒碱(CAP)和二氢辣椒碱占比在90%左右，具有抗氧化、调节炎症反应和抗菌抗病毒等多种生物学功能[10]。CAP的抗氧化功能与其酚羟基结构有紧密联系，酚羟基与羟自由基和烷氧自由基反应阻断氧化反应[11]。研究表明日粮中添加CAP可以改善断奶仔猪抗氧化能力[12]。Li等[13]发现CAP可以激活核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)信号通路，缓解热应激小鼠小肠氧化损伤。

磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路对细胞生长发育过程十分重要[14],该通路可以激活Nrf2表达[15]。Wang等[16]证明了CAP能够激活PI3K/AKT信号通路。由于Nrf2能够上调抗氧化酶活性[17],所以PI3K/AKT/Nrf2信号通路在缓解动物氧化损伤中能起到重要作用。此外，有研究表明白藜芦醇可提高猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)抗氧化能力，减少细胞内活性氧积累且与PI3K/AKT/Nrf2通路有关[15]。

目前，CAP对LPS攻毒仔猪肠道抗氧化功能的影响鲜见报道。本试验旨在探究CAP对LPS攻毒仔猪空肠和回肠抗氧化功能的影响并从分子角度初步探究其潜在信号通路，为CAP在畜牧业的应用提供理论指导。

1、材料与方法

1.1 试验材料

CAP(纯度≥0.5%)购自广州立达尔生物科技股份有限公司。LPS来源于大肠杆菌 055:B5(美国西格玛奥德里奇公司，产品编号：L2880)。

1.2 试验设计

本试验获得南京农业大学动物保护和使用委员会批准。试验选用体重相近的24头28日龄“杜×长×大”三元杂交断奶公仔猪，初始体重为(9.00±0.30)kg, 随机分为3组，每组8个重复，每个重复1头猪。对照组(CON)和LPS组饲喂基础日粮，LCA组在基础日粮中添加800 mg/kg的CAP。仔猪采用两阶段饲喂，试验周期35 d。基础日粮参照美国国家研究委员会(NRC, 2012)颁布的营养需求标准，相应成分和营养水平见表1。试验期间仔猪可自由采食和饮水。LPS组和LCA组仔猪于采样前4 h按照100 μg/kg体重的剂量腹腔注射LPS,CON组仔猪腹腔注射等剂量的生理盐水。LPS注射剂量和作用时间参照文献[18]。

1.3 样品采集

试验结束时对仔猪进行电休克，随后放血屠宰并采样。用载玻片刮取空肠和回肠黏膜样品于冻存管，立即放入液氮速冻，随后置于-80 ℃冰箱以待进一步分析。

1.4 指标测定与方法

1.4.1 抗氧化指标测定

取100 mg左右的肠道黏膜样品与生理盐水按照1∶9的比例匀浆，在4 ℃下以3 000 r/min离心15 min, 取上清液采用相应试剂盒测定总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、还原型谷胱甘肽(GSH)含量以及总蛋白(TP)含量。上述试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。此外，测定上清液中丙二醛(MDA)含量和8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量的试剂盒分别购自北京索莱宝科技有限公司和江苏酶免实业有限公司。操作步骤参照试剂盒说明书进行。所得到的试验结果用相应的总蛋白浓度进行校准。

1.4.2 抗氧化相关基因mRNA表达量的测定

在100 mg左右的肠道黏膜样品中加入TRIzol试剂，按照说明书要求提取总RNA。随后使用ND-1000微量紫外分光光度计(赛默飞世尔科技公司)检测RNA的纯度和浓度。使用HiScript®Ⅲ RT SuperMix试剂盒(诺唯赞生物科技股份有限公司)将总RNA逆转录成cDNA。使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix试剂盒(诺唯赞生物科技股份有限公司)并按照说明书要求进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参基因，使用2-ΔΔCt方法计算目的基因mRNA的相对表达量[19]。相关引物序列见表2。

表1 基础日粮组成及营养水平

表2 qRT-PCR引物序列

1.5 数据统计与分析

利用Excel (2016)对数据初步整理，随后采用SPSS 26.0软件对数据进行独立样本t检验。数据分析结果以“平均值±标准误”表示，P<0.05为差异显著。

2、结果与分析

2.1 CAP对LPS攻毒仔猪肠道黏膜抗氧化指标的影响

如表3所示，与CON组相比，LPS攻毒后显著降低空肠T-AOC以及GSH含量，增加了8-OHdG含量(P<0.05)。日粮中供给CAP时可以显著提高空肠CAT和GSH-Px活性，降低8-OHdG含量(P<0.05)。CON组与LPS组以及LPS组与LCA组之间空肠T-SOD活性和MDA含量差异不显著(P>0.05)。

此外，与CON组相比，LPS攻毒后显著降低了回肠的T-AOC和T-SOD活性以及GSH含量，增加了MDA含量(P<0.05)。而日粮中供给CAP时可以显著提高回肠T-SOD和GSH-Px活性(P<0.05)。CON组与LPS组以及LPS组与LCA组之间回肠CAT活性和8-OHdG含量差异不显著(P>0.05)。

表3 辣椒碱对LPS攻毒仔猪肠道黏膜抗氧化指标的影响(n=8)

2.2 CAP对LPS攻毒仔猪肠道黏膜抗氧化相关基因mRNA表达量的影响

如图1A所示，空肠LPS组SOD1的mRNA表达量显著低于CON组(P<0.05),LCA组PI3K、AKT、Nrf2和SOD1的mRNA表达量显著高于LPS组(P<0.05)。CON组与LPS组以及LPS组与LCA组之间空肠HO-1、SOD2、GPx1和CAT的mRNA表达量差异不显著(P>0.05)。

此外，如图1B所示，回肠LCA组GPx1的mRNA表达量显著高于LPS组(P<0.05)。CON组与LPS组以及LPS组与LCA组之间回肠PI3K、AKT、Nrf2、HO-1、SOD1、SOD2和CAT的mRNA表达量差异不显著(P>0.05)。

图1 辣椒碱对LPS攻毒仔猪空肠(A)和回肠(B)黏膜抗氧化相关基因mRNA表达量的影响(n=8)

3、讨论

3.1 CAP对LPS攻毒仔猪肠道黏膜抗氧化指标的影响

研究表明，当免疫应激发生时，机体抗氧化系统也会受到损害[6]。机体抗氧化系统包括两种类型，其中SOD、GSH-Px和CAT等属于酶抗氧化防御体系，而GSH则属于非酶抗氧化防御体系[20]。T-AOC可以体现机体综合抗氧化功能，T-SOD、CAT和GSH-Px的作用是清除机体内自由基并分解过氧化物，GSH含有能清除体内过多自由基的巯基从而起到抗氧化作用[21]。MDA和8-OHdG分别是评价脂质过氧化和DNA氧化损伤的生物标志物[22-23]。本试验结果表明，与正常仔猪相比，LPS攻毒仔猪空肠T-AOC和GSH含量、回肠T-AOC和T-SOD活性以及GSH含量显著下降，而空肠8-OHdG以及回肠MDA含量显著升高。Liu等[24]研究发现LPS攻毒显著降低了仔猪回肠T-SOD活性，同时增加了MDA含量。Zhou等[25]研究发现仔猪注射LPS后，血清和肝脏的T-AOC显著降低。上述结果说明LPS攻毒会降低肠道抗氧化酶活性，产生更多氧化代谢产物，从而使肠道发生氧化损伤。本试验发现，CAP显著提高了LPS攻毒仔猪空肠CAT和GSH-Px活性、回肠T-SOD和GSH-Px活性，同时显著降低了空肠8-OHdG含量。与上述结果相似，前人研究表明在仔猪日粮中添加CAP显著提高了血清中T-SOD和CAT活性[12]。由此可见，在LPS攻毒仔猪日粮中添加CAP能够提高肠道抗氧化酶活性，缓解脂质过氧化和DNA氧化损伤，增强机体抗氧化能力。C7-苄基碳是CAP的主要抗氧化位点[26]。在CAP中由于C7-苄基碳周围的乙酰胺部分存在共振效应，因此C7-苄基碳抗氧化优先级高于酚羟基[26]。

3.2 CAP对LPS攻毒仔猪肠道黏膜抗氧化相关基因mRNA表达量的影响

为了进一步确定CAP改善LPS攻毒仔猪肠道抗氧化系统的潜在分子机理，我们选取PI3K/AKT/Nrf2信号通路作为研究对象，发现与正常仔猪相比，LPS攻毒显著降低了仔猪空肠SOD1的mRNA表达量。SOD1又名CuZn-SOD,是动物体内SOD亚型之一[27]。与本试验结果相似，李欢等[28]研究发现LPS攻毒导致断奶仔猪十二指肠SOD1的mRNA表达量显著下降。可见LPS攻毒仔猪肠道抗氧化能力较弱的原因可能与机体内分子水平变化相关。本试验结果表明，在LPS攻毒仔猪日粮中添加CAP后，空肠PI3K、AKT、Nrf2和SOD1的mRNA表达量显著升高，而回肠GPx1的mRNA表达量显著升高。PI3K与机体许多细胞生命活动相关，其主要催化磷脂酰肌醇D3羟基磷酸化，生成磷脂酰肌醇-3,4,5三磷酸并与AKT胞内同源结构域相结合[29]。AKT通过自身磷酸化激活下游Nrf2表达[30],Nrf2进入细胞核后激活下游抗氧化酶基因表达[31]。先前的研究表明，CAP能够显著提高樱桃谷肉鸭胸肌Nrf2以及腿肌Nrf2和SOD的mRNA表达量[32]。由此可见，CAP改善空肠抗氧化系统可能是通过激活PI3K/AKT/Nrf2信号通路，进而提高空肠抗氧化酶活性。然而，日粮添加CAP未能提高PI3K/AKT/Nrf2信号通路上相关mRNA的表达量，说明CAP可能是通过其他信号通路增强回肠抗氧化功能，具体信号通路仍需进一步研究。

4、结论

日粮中添加CAP具有改善LPS攻毒仔猪肠道抗氧化酶活性，缓解脂质过氧化和DNA氧化损伤的功能，其中空肠抗氧化功能的提高可能与激活PI3K/AKT/Nrf2信号通路有关。

参考文献:

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