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香菇多糖和冷冻平衡时间对猪精液冷冻保存效果的影响

2024-11-13 62 上传者：管理员

摘要：为了研究香菇多糖和冷冻平衡时间对猪精液冷冻保存效果的影响，试验在公猪精液的冷冻稀释液中添加0.6 mg/mL的香菇多糖，冷冻平衡0,30,60,90,120,150 min后，分别采用观察法、异硫氰荧光棒标记的花生凝集素(FITC-PNA)染色法、低渗肿胀法和吖啶橙染色法检测冻后猪精子的活率、顶体完整率、质膜完整率和DNA完整性。结果表明：冻后猪精子的活率和顶体完整率随着平衡时间的延长呈先升高后降低的趋势，在平衡90分钟时达到最高，分别为45.19%、55.74%;冻后猪精子的质膜完整率在平衡30,60,120,150 min之间差异不显著(P>0.05),在平衡90分钟时最高，达到51.47%,显著高于其他平衡时间质膜完整率(P<0.05);冻后猪精子DNA完整率在平衡30,60,90,120 min之间差别不显著(P>0.05),其中平衡90 min时最高，为44.56%。说明冷冻稀释液中添加0.6 mg/mL香菇多糖并平衡90 min能显著提高猪精液的冷冻保存效果。

关键词：
冷冻保存技术
家畜品种
畜牧养殖业
香菇多糖
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精液的冷冻保存技术能够减少疾病传播、提升优秀种公畜的利用率、有利于家畜品种改良，在畜牧养殖业中具有重要意义[1-2]。在生产实践中，精液的冷冻保存技术与人工授精技术相结合可以使精子的供给不受时间和空间的限制，从而降低生产成本，提高经济效益。目前，精液冷冻保存技术已经在奶牛、肉牛等物种中得到广泛应用，但是猪精液的冷冻保存效果并不理想[3-4]。猪精子细胞对温度变化特别敏感，在冷冻过程中易发生脂质过氧化，形成低温打击，导致猪精液冷冻保存效果不理想，很大程度上限制了猪精液冷冻保存技术在生产中的推广应用[5]。经过多年的探索，研究人员发现冻前平衡和添加冷冻保护剂可有效减少冷冻损伤[6-7]。冷冻前适当延长冷冻平衡时间能够使精子细胞适应外界环境的变化，减少冷冻损伤。另外，在平衡过程中添加适当的冷冻保护剂也能有效改善冻后精子质量[8-10]。但是不同冷冻保护剂的最佳冷冻平衡时间是不同的[11]。因此，针对特定的冷冻保护剂探索其最适冷冻平衡时间对于提高精液冷冻保存效果是必要的。

香菇多糖是从香菇籽实体中提取的一种多糖，具有调解机体免疫力、抗病毒、抗肿瘤等作用[12]。近年来，研究人员发现，在奶牛[13]和湖羊[14]的精液冷冻过程中添加香菇多糖均能有效提升冻后精子质量。同样，裴一飞[15]的研究结果也表明，在冷冻稀释液中添加浓度为0.6～0.9 mg/mL的香菇多糖能够提升猪精液冷冻保存效果。本试验在冷冻基础液中添加0.6 mg/mL的香菇多糖，探索不同的冷冻平衡时间对猪精液冷冻保存效果的影响，以期为猪精液冷冻保存效果的研究提供参考。

1、材料

1.1 试验动物

采用手握法采集来自哈尔滨市香坊区香农养殖场1.5～2岁、体质健康、性欲旺盛的大白猪公猪的中段精液，用无菌纱布过滤后在37 ℃条件下进行常规品质检查，选择无异味、乳白色、活率在0.7以上、密度为“密”的精子带回实验室进行后续试验。

1.2 主要试剂

二水柠檬酸钠、碳酸氢钠、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、柠檬酸、氯化钾，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；甲醇，购自上海麦克林生化科技有限公司；葡萄糖、果糖、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、罗丹明、碘化丙啶、异硫氰荧光素标记的花生凝集素(FITC-PNA),均购自Sigma公司；吖啶橙，购自MCE公司；青霉素钠、硫酸链霉素，均购自国药集团国瑞药业有限公司；香菇多糖，购自北京索莱宝科技有限公司；封片剂，购自北京索莱宝科技有限公司；卡诺氏液，购自上海奥吉生物技术有限公司。

1.3 主要仪器

低温保存箱，购自耐尔尼公司；光学显微镜，购自奥林巴斯公司；荧光显微镜，购自Zeiss公司；低温离心机，购自德国Hettich公司。

2、方法

2.1 试剂的配制

基础稀释液(BTS):称取葡萄糖3.7 g, 二水柠檬酸钠0.6 g, EDTA-2Na 0.125 g, 碳酸氢钠0.125 g, 氯化钾0.008 g, 青霉素钠0.06 g, 硫酸链霉素0.1 g, 加双蒸水至100 mL。

冷冻基础液(TCG):称取 Tris 2.42 g, 葡萄糖1.1 g, 柠檬酸1.48 g, 硫酸链霉素0.1 g, 青霉素钠0.06 g, 加双蒸水至100 mL。

低渗液：称取果糖1.351 g, 二水柠檬酸钠0.735 g, 加双蒸水至100 mL。

冷冻稀释Ⅰ液：分别量取80%的冷冻基础液和20%的卵黄并将二者充分混合，然后添加香菇多糖，使其终浓度为0.6 mg/mL。

冷冻稀释Ⅱ液：在冷冻稀释Ⅰ液中加入甘油，使甘油的终浓度为3%。

2.2 精子的冷冻与解冻

用基础稀释液按照1∶1的比例稀释精液，用离心管等量分装后以10层以上纱布包裹，置17 ℃保温箱中平衡2 h; 17 ℃、2 400 r/min离心10 min; 弃上清液，加入冷冻稀释液Ⅰ液，置4 ℃恒温箱中分别平衡0,30,60,90,120,150 min; 缓慢加入冷冻稀释液Ⅱ液，置4 ℃恒温箱中分别平衡60 min; 装入0.25 mL精液冷冻细管中，于液氮面3～5 cm处熏蒸10 min后放入液氮中冷冻保存。解冻时将精液冷冻细管从液氮中取出，放于温度为37 ℃的水浴锅中45 s, 解冻后的精子用于后续试验分析。

2.3 精子活率的检测

将解冻后的精液与基础稀释液等比例混合，吸取20 μL稀释后的精液加到载玻片上，在光学显微镜下观察精子运动情况，统计直线运动精子的比例。

2.4 顶体完整性的检测

利用FITC-PNA染色法检测解冻后精子的顶体完整性。取30 μL精液样本进行涂片，在空气中干燥后加甲醇溶液中固定10 min; 加入30 μL FITC-PNA工作液，将玻片放于湿盒中，避光，37 ℃孵育30 min; PBS清洗后，滴加封片剂于荧光显微镜下观察。

2.5 质膜完整性的检测

利用低渗肿胀法(HOST)检测冻融后精子质膜的完整性。吸取解冻后的精液样本50 μL加到1 mL低渗液中，37 ℃孵育30 min; 吸取精液20 μL在光学显微镜下观察(质膜完整的精子在低渗液的作用下尾部会出现弯曲),统计弯尾精子所占比例。

2.6 DNA完整性的检测

将解冻后的精液进行涂片，室温放置5～10 min使其自然干燥；加到卡诺氏液中固定30 min; 用PBS清洗去掉固定液，加入吖啶橙染液染色10 min; 用PBS洗掉多余的染液，在荧光显微镜下观察，发出红色或黄色荧光的为DNA损伤的精子，发出绿色荧光的为具有DNA完整性的精子，统计发出绿色荧光精子所占比例。

2.7 数据的统计分析

利用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析和邓肯氏多重比较分析，结果用“平均值±标准误”表示，P>0.05表示差异不显著，P<0.05表示差异显著。

3、结果与分析

3.1 香菇多糖和平衡时间对冻后猪精子活率的影响

结果见图1。

由图1可知：在0～90 min内，冻后精子的活率随着平衡时间的延长而增加；在平衡90分钟时，冻后精子活率最高，为45.19%,显著高于其他平衡时间(P<0.05);随着平衡时间的继续延长，冻后精子活率逐渐下降。

图1香菇多糖和平衡时间对冻后精子活率的影响

3.2 香菇多糖和平衡时间对冻后猪精子顶体完整性的影响

结果见126页彩图2和图3。

图2FITC-PNA染色结果

Fig.2FITC-PNA staining result

图3香菇多糖和平衡时间对冻后精子顶体完整性的影响

由126页彩图2和图3可知，随着平衡时间的延长精子顶体完整率呈现先增高后降低的变化趋势。其中在平衡90分钟时，精子冻后的顶体完整率最高，为55.74%,显著高于其他平衡时间精子顶体完整率(P<0.05)。

3.3 香菇多糖和平衡时间对冻后猪精子质膜完整性的影响

结果见126页彩图4和图5。

图4低渗肿胀试验结果

图5香菇多糖和平衡时间对冻后精子质膜完整性的影响

由126页彩图4和图5可知，在平衡90分钟时，冻后猪精子质膜完整率最高，为51.47%,显著高于其他平衡时间精子质膜完整率(P<0.05);平衡30,60,120,150 min的冻后精子的质膜完整率差异不显著(P>0.05)。

3.4 香菇多糖和平衡时间对冻后猪精子DNA完整性的影响

结果见126页彩图6和图7。

图6吖啶橙染色结果

图7香菇多糖和平衡时间对冻后精子DNA完整性的影响

由126页彩图6和图7可知，在平衡30,60,90,120分钟时，冻后精子DNA完整率差异不显著(P>0.05)。其中平衡90分钟时，冻后精子DNA完整率最高，为44.56%;4 ℃未平衡的冻后精子DNA完整率最低，为40.43%。

4、讨论

精液稀释后的冷冻平衡过程是精液冷冻保存过程中的重要环节。C.Polge等[16]在研究公牛精液冷冻保存时最早提出了经过一段时间的冷冻平衡后精液的冷冻效果能得到明显改善。本研究探讨了猪精液冷冻过程中香菇多糖的最适平衡时间，结果表明在冷冻基础液中添加0.6 mg/mL的香菇多糖，冷冻平衡90 min猪精液的保存效果最好。

猪精子在降温过程中活力会下降，尤其在采精后至15 ℃和从5 ℃至0 ℃这段时间[17]。T.Almlid等[18]研究发现，在温度降至0 ℃时加入甘油处理不同时间对冻后精子活率没有影响，而温度降至5 ℃时加入甘油则能明显提高冻后精子活率。因此，5 ℃左右这个温度区间对冻后精子活率有很大影响。近年来的多项研究结果表明，在5 ℃的冷冻平衡过程中添加冷冻保护剂都能显著提升冻后猪精子的活率[19-20]。L. A. Johnson等[5]研究发现，适当延长5 ℃的平衡时间可明显提高精子的冷冻效果。本研究也发现，添加香菇多糖的冷冻稀释液在4 ℃平衡90 min后的冷冻猪精子的活率最高，但是随着平衡时间的延长猪精子活率反而下降。这可能是因为冷冻保护剂对精子细胞也是有毒性的，长时间作用反而会降低精子质量[21]。

P. S. Fiser等[22]利用0.5 mL的细管研究了降温速度对冻后猪精子顶体完整率的影响，结果发现：冻后精子的顶体完整性与抗冻剂浓度和降温速率有关。当甘油浓度为0～1%时，以30 ℃/min的降温速度冷冻精子，可以获得最高的冻后顶体完整率；如果以1 ℃/min的速度降温时，顶体完整率随着甘油浓度的增加而下降；若直接将精液投入液氮中，精子的顶体完整率为0。本研究结果也表明，冻后精子顶体完整性受到平衡时间的影响，随着平衡时间的延长，精子顶体完整率先升高后降低，其中平衡90 min的精子顶体完整率最高。

猪精子质膜中含有很多不饱和脂肪酸，在冷冻降温过程中易形成氧自由基，造成脂质过氧化，从而影响冻后精子质量[5]。香菇多糖是从香菇籽实体中提取的一种多糖，具有抗氧化活性[23-24]。裴一飞[15]的研究结果表明，添加香菇多糖有助于提升冻后猪精子的质膜完整率。本研究发现，添加香菇多糖并平衡90 min精子的质膜完整率最高，可能是因为在冷冻平衡过程中，精子需要一定时间调整脂肪浓度来适应外界的低温环境，使精子质膜达到稳定状态，但是具体的分子机制还需进一步验证。

5、结论

本研究结果表明，在猪精液冷冻基础液中添加0.6 mg/mL香菇多糖后于4 ℃平衡90 min能显著提高冷冻-解冻后猪精子活率、顶体完整率、质膜完整率和DNA完整率。

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基金资助:国家生猪技术创新中心先导项目(NCTIP-XD1C16);国家自然科学基金项目(U20A2052);黑龙江省省属科研院所科研业务费项目(CZKYF2023-1-C004);黑龙江省农业科学院创新跨越工程科技攻关项目(2021YYYF021);黑龙江省农业科学院博士后科研启动金项目;

文章来源:王芳,亓美玉,马红,等.香菇多糖和冷冻平衡时间对猪精液冷冻保存效果的影响[J].黑龙江畜牧兽医,2024,(21):51-54+126.