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金银花源miR2911靶向非洲猪瘟病毒基因区域分析

2023-10-26 53 上传者：管理员

摘要：金银花源miR2911是一种高丰度、性质稳定的抗病毒分子,在抗流感病毒感染、 SARS-CoV-2感染中具有一定效果。然而,对于miR2911靶向ASFV基因区域的研究却鲜有报道。由此,本研究旨在分析miR2911靶向ASFV的基因区域,从而进一步分析miR2911靶点在不同流行毒株中的保守性。利用miRanda软件成功预测了miR2911在ASFV基因组中存在的多个靶点,且靶向ASFV基因区域保守性很高。为后续深入研究miR2911在抗猪源病毒感染机理方面提供理论依据。

关键词：
miR2911
猪病
病毒基因
金银花
非洲猪瘟
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mi RNA (micro RNA）是一类长约19～25 nt的非编码RNA，具有较高的保守性[1,2]。一般mi RNA的成熟需要经过3个阶段：在细胞核中转录得到pri-mi RNA、由RNaseⅢ-Drosha酶剪切得到pre-mi RNA、由premi RNA运转出核进入胞浆内并成熟[3,4,5,6,7]。含有mi RNA引导链的RISC与靶m RNA的3’UTR不完全互补配对时会阻碍靶蛋白的翻译，从而抑制目的基因的表达；mi R-NA与靶m RNA发生完全互补配对时，靶m RNA则被AGO2蛋白降解[8]。由于mi RNA序列、结构多样，其在生物调控及蛋白质合成方面发挥着重要作用，包括病毒细胞的增殖与凋亡、癌症治疗等方面[9,10]。

金银花是一种重要的药用植物，因为具有多种生物活性，所以在生理上主要有解热、抗炎、抗菌、抗氧化等作用，其作为中药材被广泛应用于治疗流感病毒等方面[11]。2015年Zhou等[12]发现灌服金银花汤后的小鼠体内mi R2911丰度较高。由于mi R2911的功能在于能够靶向多种甲型流感病毒（IAVs），所以化学合成的mi R2911不但可以显著抑制H1N1的PB2和SN1蛋白的表达，而且还能降低H5N1感染小鼠的死亡率。最新研究显示，mi R2911可有效抑制SARS-Co V-2（新型冠状病毒）的复制，并且mi R2911在SARS-Co V-2基因区域存在多个抑制靶点[13]，因此，猜测金银花mi R2911可能具有较广泛的抗病毒作用。

非洲猪瘟病毒（ASFV）是一种双链DNA病毒，属于非洲猪瘟病毒科（Asfarviridae）非洲猪瘟病毒属（Asfivirus）。ASFV病毒粒子直径一般可达260～300 nm，其基因组长度介于170～193 kb，可编码150～167个蛋白。并且ASFV是一种烈性病毒，急性期ASFV可引起猪100%的死亡率，感染ASFV的病猪症状包括嗜睡、血性腹泻、高热、血管变化等[14,15]。目前已研发出的非洲猪瘟灭活疫苗无法完全诱导生猪机体产生中和抗体，且效果不佳，而基因缺失疫苗正在研发中。因此，针对非洲猪瘟病毒缺乏有效的治疗手段，仍需要以防控为主。

鉴于mi R2911具有强大的抗病毒功效，本文通过生物信息学等方法，探讨金银花源mi R2911对ASFV相关基因靶向区域，以期为研发抗ASFV感染的药物提供理论依据。

1、试验材料与方法

1.1 金银花mi R2911序列获得

在mi Rbase数据库中，下载金银花源mi R2911的成熟序列，5’-GGCCGGGGGACGGACUGGGA-3’。

1.2 ASFV全基因序列下载

进入NCBI数据库，搜索ASFV的全基因组序列，下载我国当前非洲猪瘟病毒流行毒株的全基因组序列。

1.3 mi RNA靶向ASFV基因区域预测

在windows环境下，打开网页版本的mi Randa软件，在操作界面输入mi RNA序列和ASFV全基因组序列，点击分析，则会运行程序显示分析结果。

1.4 靶向区域进化树构建

在构建mi R2911靶向ASFV基因区域进化树时，先将每个病毒被靶向区域与其他流行毒株进行比对，从而获取不同毒株相应靶向区域。每个毒株被靶向区域按照一定顺序拼到一起，1个毒株作为1个整体的基因序列，利用MAGE7软件，按照临近法构建进化树，相当于多基因法构建进化树。

2、结果与分析

2.1 mi R2911靶向ASFV基因区域预测

利用mi Randa软件预测，首先，将mi R2911分别靶向ASFV的NP1450L基因、GL1340L基因、MGF＿110-5L-6L基因及EP1242L基因等4个基因的2个区域，其中对NP1450L基因130 231～130 255区域的靶向性较好，其分值为108分，自由能（Energy）为-35.37k Cal/Mol。其次，mi R2911对ASFV的G1340L基因的112 860～112 881区域靶向时，其分值可以达到102分，自由能（Energy）为-25.40 k Cal/Mol；在靶向ASFV的EP1242L基因的2个区域（69 000～69 022和67 435～674 54）时，区域69 000～69 022的靶向性相对较高，其分值可达99分，自由能可达到-32.02k Cal/Mol；靶向ASFV的MGF＿110-5L-6L基因的10 218～10 237区域，其分值为93分，自由能为-23.81k Cal/Mol。综合mi R2911靶向AFSV的4个基因的各项数据，表明mi R2911具有潜在抑制AFSV中NP1450L基因和ASFV G1340L基因复制的能力（图1）。

图1 mi R2911靶向ASFV基因分析结果

2.2 mi R2911靶向ASFV基因区域序列进化树分析

在NCBI数据库中，下载mi R2911靶向ASFV基因区域序列，将多个区域按先后串联，利用MEGA 7.0软件中邻近法构建mi R2911靶向病毒基因区域进化树，mi R2911靶向ASFV的基因区域100%同源（图2）。

3、讨论

金银花性甘、寒，具有多种生物活性，可起到清热解毒，消炎退肿的作用；金银花与其他中药配伍后可预防和治疗病毒性感染。据报道，金银花源mi R2911通过与病毒特定基因序列的相互作用，可以有效抑制病毒的复制，在抗病毒方面发挥着重要作用。在畜禽养殖过程中，抗病毒感染与治疗是当前全球范围内探讨的一个热点话题。研究表明，mi R2911性质稳定，经口服可被动物体吸收。鉴于mi R2911的抗病毒作用，以mi R2911为研究对象，通过应用mi Randa软件分析mi R2911靶向ASFV基因的具体区域、分值及自由能的高低，从而进一步分析mi R2911靶向病毒区域的保守性，以期为治疗猪病毒性传染病提供借鉴。

图2 mi R2911靶向ASFV基因多区域序列进化树

自2018年非洲猪瘟疫情在我国发生以来，猪主要病毒性传染病防控形势愈发严峻，“老病未灭，新病又起”是我国目前养猪业面临的主要问题。目前病毒性传染病往往需要免疫疫苗进行防控，还没有特效治疗药物。经研究考虑到金银花源mi R2911在抵抗流感病毒感染和新型冠状病毒感染时发挥的中药作用，猜测金银花mi R2911可能在ASFV基因上存在潜在的靶向位点，并利用mi Randa软件成功预测了mi R2911在ASFV基因上的靶向位点。由于mi R2911在猪病毒基因上的靶向区域很多，所以将得分低于82分的全舍弃。mi R2911可靶向ASFV的4个基因，其中在ASFV的EP1242L基因上有2个靶向区域。

非洲猪瘟病毒中的NP1450L、EP1242L和MGF＿110-5L-6L等3个基因在病毒感染生猪过程中发挥重要作用。NP1450L蛋白与RNA聚合酶的最大亚基具有广泛的相似性。而EP1242L蛋白类似于第2大RNA聚合酶亚基。NP1450L蛋白和EP1242L与真核RNA聚合酶Ⅱ的亚基更相似；NP1450L和EP1242L主要在非洲猪瘟病毒感染晚期开始表达。外源表达MGF110-5L-6L蛋白还可诱导高尔基体和过氧化物酶体的亚细胞定位与形态发生显著改变，认为MGF110-5L-6L蛋白可能通过影响内质网腔中氧化还原稳态、蛋白质分泌途径及相关膜性细胞器发生等，而打破细胞的正常生理功能稳态，导致猪只发病。已证实外源表达MGF110-5L-6L蛋白可诱导宿主细胞发生内质网应激和未折叠蛋白反应，并通过活化PERK和PKR激酶触发e IF2α的磷酸化，进而诱发综合应激反应，致使猪机体的细胞蛋白翻译阻滞以及应激颗粒产生。

mi R2911在非洲猪瘟病毒基因中的靶点非常保守，不同时期和不同地区的非洲猪瘟病毒分离毒株的靶点同源性很高。因此，金银花源mi R2911具有潜在抑制当前非洲猪瘟病毒流行毒株复制的作用。下一步，将与其他实验室合作，构建mi R2911过表达质粒，在细胞水平验证mi R2911抑制上述病毒复制的能力；在此基础上，进一步将mi R2911导入酵母菌、马铃薯、番茄、苜蓿等植物中，通过给猪只饲喂上述转基因菌株的植物，提高猪抗病毒的能力。并通过检测猪只排毒情况和病理损伤程度，在动物体内开展mi R2911抗病毒感染作用。

4、结论

本试验通过生物信息学方法预测了mi R2911对非洲猪瘟病毒关键基因的靶向性并对此展开分析。mi R2911可较好地靶向非洲猪瘟病毒的NP1450L基因，显示出mi R2911潜在抑制非洲猪瘟病毒复制的能力。根据遗传进化树结果显示mi R2911在非洲猪瘟病毒基因上的靶向区域100%同源，表明mi R2911具有靶向不同流行非洲猪瘟病毒毒株的能力。综上所述，本文发现mi R2911对于非洲猪瘟病毒具有潜在抑制作用，为进一步探索其抑制原理及相关药物的研发提供理论依据。

基金资助:新疆维吾尔自治区青年科学基金项目(2022272375);石河子大学高层次人才科研启动项目(RCZK202043);石河子大学青年创新培育人才项目(CXPY202211);

文章来源:杜非凡,陈星宇,李硕等.金银花源miR2911靶向非洲猪瘟病毒基因区域分析[J].中国猪业,2023,18(05):70-73.