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猪瘟疫苗及胎牛血清中牛病毒性腹泻病毒污染情况调查

2023-10-26 56 上传者：管理员

摘要：目前,我国对生猪重大疫病的防控主要依赖疫苗免疫,且猪群疫病商品化疫苗主要以弱毒苗为主。猪瘟弱毒疫苗是预防猪瘟最常用的理想疫苗,但是,部分生产厂家在猪瘟弱毒苗生产过程中,往往由于使用胎牛血清而出现外源病毒感染的情况,如最常见的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)。BVDV感染猪群后,可降低猪瘟疫苗的免疫效价,造成疾病传播的风险。为调查伊犁河谷商品化猪瘟疫苗和胎牛血清中牛病毒性腹泻病毒污染的情况,本文对市售的5家厂商生产的不同种类的猪瘟疫苗和6家厂商生产的不同批号的胎牛血清,采用实时荧光定量RT-PCR方法进行BVDV检测。结果显示,猪瘟疫苗中BVDV核酸检测阳性率为18.2%,胎牛血清中BVDV核酸检测阳性率为8.3%,这为伊犁河谷养猪场及科研单位选用安全可靠的猪瘟疫苗与胎牛血清提供了技术支撑。

关键词：
污染
牛病毒性腹泻病毒
猪瘟疫苗
胎牛血清
调查
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猪瘟的防控主要依靠疫苗免疫，但猪瘟疫苗在临床使用过程中常常出现免疫失败的现象。研究表明，这与外源病毒的干扰有关，其中BVDV的干扰是猪瘟疫苗免疫失败的重要原因之一。BVDV自然感染猪会出现类似猪瘟的临床症状，主要包括仔猪生长发育不良、僵猪、贫血、结膜炎和腹泻等。猪感染BVDV后表现出的具体临床症状和病理变化也不尽相同，如仔猪先天性感染BVDV可产生抗体，也可发展为持续性感染，并在感染后数天内死亡；母猪自然感染BVDV后可出现受孕率降低、流产和产死胎等现象；肥猪感染BVDV后主要以慢性胃肠炎和败血症为特征，类似于慢性猪瘟。BVDV广泛存在于胎牛血清中，猪瘟疫苗的研制不可或缺的要使用胎牛血清，若使用了被BVDV污染的胎牛血清，则该病毒会大幅降低猪瘟疫苗的免疫质量，导致猪瘟疫苗免疫失败。因此，检测胎牛血清和猪瘟疫苗中是否存在BVDV污染意义重大。本文采用实时荧光定量（RT-PCR）方法对伊犁河谷市售猪瘟疫苗和胎牛血清进行BVDV检测，以期为养猪企业选择猪瘟疫苗提供参考。

1、试验材料与方法

1.1 试剂与仪器

RNA提取试剂盒和荧光定量PCR试剂均购自大连宝生物公司；CFX96荧光定量PCR仪购自美国BIO-RAD公司。低温高速冷冻离心机购自上海卢湘仪离心机仪器有限公司。涡旋振荡器购自深圳市科力易翔仪器设备有限公司；恒温水浴锅购自北京亚欧德鹏科技有限公司。

1.2 猪瘟疫苗和胎牛血清

新疆伊犁河谷地区市面所售的来自不同厂家的猪瘟疫苗和胎牛血清，具体信息见表1。

1.3 引物合成

参照陈其兵等[1]合成引物及探针的方法，设计荧光定量所需引物及探针，交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

上游引物PF 5’-GAGTACAGGGTAGTCGTCAGT GG-3’

下游引物PR 5’-CTCTGCAGCACCCTATCAGG-3’

荧光探针PB 5’FAM-AGATGCCACGTGGACGAG GGC-BHQ1 3’

1.4 RNA的提取

取稀释后的猪瘟疫苗250μL加入750μL Trizol，振荡混匀后室温放置5 min，再加入氯仿溶液250μL，充分振荡混匀后室温放置10 min,4℃12 000 rpm离心15 min，取500μL上清液，加入等量的异丙醇溶液混匀，静置30 min后，4℃12 000 rpm离心10 min，弃去上清，用1 m L 75%的乙醇洗涤沉淀物，4℃12 000rpm离心5 min弃去上清，将离心管在室温下静置干燥20 min，然后加入30μL dd H20，充分溶解后-20℃保存备用。

1.5 荧光定量RT-PCR

反应体系为：2×One Step RT-PCR BufferⅢ10μL,10μM Taq Man探针0.4μL,10μM上游引物0.4μL,10μM下游引物0.4μL、Ta Ka Ra Ex Taq HS 0.4μL、Prime-Script RT Enzyme MixⅡ0.4μL、Rox Reference Dye 0.4μL、DEPC H2O 5.6μL、模板2μL。

表1待检生物制剂样品信息

反应条件为:42℃5 min,95℃10 s;95℃5 s,60℃40 s（收集荧光FAM,40个循环）。

2、结果与分析

对来自伊犁河谷地区市场上销售的11份猪瘟疫苗和12份胎牛血清进行BVDV实时荧光定量RT-PCR检测。结果显示，猪瘟疫苗中共检出2份BVDV阳性样品，阳性率为18.2%，阳性样本均为细胞源猪瘟疫苗，分别来自于国内疫苗生产厂家B和E。胎牛血清检出1份BVDV阳性样品，阳性率为8.3%，阳性样本为H生产厂家H-1批号样品，具体见表2。

3、讨论

3.1 BVDV感染对猪瘟疫苗的免疫干扰

在国内猪瘟弱毒疫苗中，时常有猪瘟疫苗被外源病原污染的报道，且污染源常为牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和支原体[2]。牛病毒性腹泻病毒自首次被报道以来，在全世界很多畜牧业发达国家中流行[3]，如澳大利亚、德国等国家的猪群中BVDV抗体阳性率达3%～40%，荷兰达15%～20%。各种年龄的牛都可感染牛病毒性腹泻病毒，以幼龄牛易感性最高，在垂直传播后，会产生病毒血症[4]。

受BVDV感染的猪瘟疫苗，往往会导致猪瘟免疫失败。主要原因是BVDV可以对猪瘟疫苗的免疫产生干扰，不仅能抑制猪瘟抗体的产生，而且还可以刺激猪体产生大量的BVDV抗体。因此，在生产过程中猪场内猪瘟抗体明明很高，但却依然时有猪瘟的发生，究其原因是在检测的抗体中，猪瘟保护抗体很少，大部分可能为BVDV抗体[5]。

表2 伊犁河谷地区市售生物制剂样品中BVDV感染情况检测结果

3.2 BVDV存在于胎牛血清中造成猪瘟弱毒疫苗的污染

目前，我国规模化牛场中牛病毒性腹泻病毒的感染率很高，很多地方对该病还未引起足够重视。陶洁等[6]于2017—2020年间对上海不同区猪场的血液样品，利用多重RT-PCR方法进行BVDV检测与分析。结果表明，上海地区猪群BVDV的总体检出率为7.14%，且呈现逐年递增的趋势。笔者曾调查过伊犁地区规模化牛场BVDV的感染率，个别牛场的感染率高达90%以上。胎牛血清是细胞培养的重要原料，以含BVDV的血清作为原料时，就会污染所制备的生物制品[7]，如猪瘟细胞苗生产过程中会使用到牛睾丸细胞及胎牛血清，在猪繁殖与呼吸综合症（蓝耳病）疫苗生产工艺的传代细胞培养中也会使用到胎牛血清，如果胎牛血清中含有BVDV病原或抗体，会使猪瘟细胞苗和猪蓝耳病疫苗遭到污染[8]。温树波等[9]从进口胎牛血清中成功分离到1株非致细胞病变型BVDV 1b亚型毒株。李艳萍等[10]从商品化的胎牛血清中分离到1株致细胞病变（CP）型BVDV(GS2018株）。张超等[11]从进口胎牛血清中分离出1株BVDV-2型非致细胞病变毒株，从脱脂奶粉中检测到BVDV抗体，表明进口胎牛血清和脱脂奶粉中都存在BVDV抗原和抗体污染。鞠厚斌[12]等对国内市售的胎牛血清进行荧光RT-PCR检测牛病毒性腹泻病毒。结果显示，胎牛血清BVDV核酸阳性率为50%。刘阳等[13]研究发现猪瘟脾淋苗与细胞苗都能刺激机体产生免疫应答，无论是标准剂量还是加大剂量，细胞苗的免疫效果都优于脾淋苗。

细胞苗的广泛使用，一定程度上增加了猪瘟疫苗被BVDV污染的风险。这给疫苗的使用和推广带来了很多潜在的风险，使用无BVDV污染并且无BVDV抗体的牛供应细胞和血清是生产高安全性猪瘟疫苗的关键。加强对疫苗等生物制剂的制作工序及生产原料的监管，是企业和政府职能部门当务之急的重要工作，应当引起足够的重视。

3.3 改善弱毒疫苗生产工艺,有效防范外源性感染

改进弱毒疫苗等生物制剂的生产工艺，也是当前破解疫苗中BVDV污染现状的一个有效途径。目前，有疫苗生产企业在使用放射性钴-60对血清等进行辐射操作，以期杀灭血清中的BVDV；也有一些生物制剂厂家在研究无血清的细胞培养基，避免因原料污染而导致疫苗出现问题；还有企业在研究胎牛血清替代品，如马血清等。

3.4 分子生物学方法能有效检测BVDV

建立特异性强、准确率高的检测方法是筛查猪瘟疫苗及胎牛血清中牛病毒性腹泻病毒污染的关键。于新友等[14]建立的双重荧光PCR方法灵敏度高、特异性强、精密性好，可用于猪用疫苗中外源病毒的快速检测及猪用疫苗等生物制品的质量控制。本文利用已成熟的BVDV实时荧光定量RT-PCR方法对样品进行检测，对检测出的阳性样品送第三方检测机构复检，结果相似度100%。检测结果表明，伊犁河谷市售的猪瘟疫苗和胎牛血清存在BVDV的污染，这为伊犁河谷市规模化猪场选择安全性高的生物疫苗提供了依据。但同时疫苗中RT-PCR检测BVDV也存在一定问题，若疫苗中存在灭活的少量BVDV也能被检测到，因此，检测到的病毒有可能是灭活的BVDV。如何在有限的时间内区分BVDV的活性，是值得学者研究的方向。

4、小结

目前，新疆部分地区大型规模养猪场猪瘟抗体合格率普遍高于中、小型规模养猪场，说明大型规模养猪场在猪瘟的防控方面具有一定优势[15]，中小规模猪场还存在一定的猪瘟野毒感染风险。伊犁地区的生猪存栏量较大，且以中小型规模猪场为主，每年猪用疫苗的使用量相当大，这也使很多疫苗生产厂家为了抢占伊犁生猪市场，打价格战造成疫苗质量得不到保障。伊犁河谷市所售的猪瘟疫苗种类繁多，猪场使用疫苗后，生猪时常出现类似猪瘟的临床表现，这也提示养殖企业要加强对猪源BVDV的检测，为伊犁地区生猪产业的健康发展提供保障。

参考文献:

[1]陈其兵,薛霜,漆世华,等.牛病毒性腹泻粘膜病病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J].中国兽药杂志,2012,46(4):46-47.

[2]毛晓娜,缪芬芳,季伟.牛病毒性腹泻病毒在猪瘟疫苗中的污染情况及检测方法的研究进展[J].中国畜牧兽医,2013,40(2):175-179.

[3]邓宇.我国部分地区猪源牛病毒性腹泻病毒研究[D].成都:四川农业大学,2012.

[4]朱礼倩,周艳君,于海,等.牛病毒性腹泻在中国的流行现状分析[J].中国动物传染病学报,2011,19(5):83-86.

[5]宋永峰,张志,张燕霞,等.猪源牛病毒性腹泻病毒的流行初探[J].中国动物检疫,2008,25(7):25-27.

[6]陶洁,李本强,程靖华,等.猪群中牛病毒性腹泻病毒的流行病学调查[J].上海农业学报,2022,38(5):84-88.

[7]范学政,宁宜宝,王琴,等.用RT-PCR方法检测检测猪瘟细胞苗中污染牛病毒性腹泻病毒[J].中国兽医杂志,2010,46(1):8-10.

[8]叶兆美.猪瘟和蓝耳疫苗中BVDV和PCV污染情况调查[J].四川畜牧兽医,2012,39(3):31-33.

[9]温树波,宋扬,蒙小刚,等.一株进口胎牛血清源BVDV毒株的分离与鉴定[J].中国病原生物学杂志,2021,16(7):743-746.

[10]李艳萍,王立群,李慧霞,等.一株源于商品胎牛血清的BVDV-2型的分离鉴定及基因组序列分析[J].畜牧兽医学报,2020,51(2):320-328.

[11]张超,何金科,何延华,等.胎牛血清中牛病毒性腹泻病毒2型毒株分离及脱脂奶粉中抗体的检测[J].中国畜牧兽医,2020,47(7):2239-2247.