本次实验选用坐骨神经轻度慢性压迫性神经损伤(minor chronic constriction injury，minor CCI)模型大鼠模拟临床pNP，进行三法三穴(点法、拨法、揉法三法；殷门、承山、阳陵泉三穴)推拿1次干预后，选取不同的时间点进行冷、热、机械刺激痛、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)以及实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR)等行为学和分子生物学检测方法进行比较，以选取推拿后镇痛疗效显著时间点，为后期推拿镇痛启动机制研究提供依据。

1、材料与方法

1.1 实验动物与分组

49只体质量为200～220 g的SPF级雄性SD大鼠，由斯贝福(北京)生物科技有限公司[SCXK(京)2019-0010]提供，北京中医药大学动物伦理委员会批准(审查编号：BUCM-4-2022082605-3043)。于北京中医药大学实验动物中心[SYXK(京)2020-0033]进行饲养，每笼3只，相对湿度(50±5)%，室温(25±1)℃，适应性饲养7 d后开始正式实验，按实验动物使用的原则并每天给予大鼠进行接触(daily handling)等人文关怀。

采用随机数字表法将经过痛阈均一筛选合格后的49只SD大鼠分为7组，即假手术组、模型组、推拿后即刻组、推拿后6 h组、推拿后12 h组、推拿后18 h组、推拿后24 h组，各7只。

1.2 仪器设备

智能冷热板测痛仪(安徽正华生物仪器设备有限公司，型号ZH-6C)；热刺痛仪(成都泰盟软件有限公司，型号PL-200)；小动物吸入式麻醉机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，型号R500)；酶标仪(美谷分子仪器(上海)有限公司，型号SpectraMax M2)；电子机械测痛仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，型号BIO-EVF5)；荧光定量PCR仪[伯乐生命医学产品(上海)有限公司，型号CFX96 TOUCH]；按摩推拿手法模拟仪(自制，中国发明专利号：No.ZL 2023 20511277.5)。

1.3 主要试剂

RNA提取液，RNA溶解液，PBS，1×Phosphate Buffered Saline，Water Nuclease-Free，SweScript All-in-One RT SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Remover)，2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix，氯仿代替物，引物，异丙醇，无水乙醇(qPCR实验所需试剂均来自武汉赛维尔科技有限公司)；动物用异氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，规格R510-22-16)；IL-10、TNF-αELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，规格96T)；75%乙醇消毒液(山东安捷高科消毒科技有限公司，规格500 mL)；戊巴比妥钠[西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，CAS：57-33-10]。

1.4 模型建立[1,2]

造模前24 h禁食水，将大鼠置于通有异氟烷的麻醉盒内(输出浓度约5%)，待角膜反射消失后，取出以俯卧位置于大鼠固定器上，并使大鼠小剂量持续吸入麻醉剂(输出浓度2%～3%)。将其右侧髋骨与股骨交界区进行剃毛、消毒，沿坐骨神经干体表投影于坐骨结节下缘部进行0.5～1 cm大小的切口，将坐骨神经干进行钝性分离并暴露。于坐骨神经远端分叉前采用4-0铬制可吸收性外科缝线进行结扎一个线结，力度大小以不影响神经外膜血流为准，其中假手术组仅暴露神经不结扎。逐层缝合，待大鼠复苏转移至饲养室。

1.5 干预方法

造模后7 d，对推拿各亚组进行1次推拿干预。将自制按摩推拿手法模拟仪设置参数为力量4N，频率每分钟60次，对右侧殷门、承山、阳陵泉三穴分别进行模拟点法、拨法、揉法操作(穴位定位方法参照《实验动物穴位图谱》)，每法每穴干预1 min，共9 min。假手术组与模型组分别进行抓握束缚9 min。

1.6 检测方法

1.6.1 行为学检测

对假手术组、模型组、推拿5个亚组分别进行在造模前、造模后、干预后进行冷痛敏阈值、机械缩足反射阈值及热缩足反射潜伏期检测。测试期间室温及相对湿度与饲养室保持一致，环境噪音≤40 dB。

1.6.1.1 冷敏阈值(cold sensitivity threshold，CST)检测

1)设置参数：将ZH-6C智能冷热板测痛仪表面温度设置为(4±1)℃，检测时间设置为5 min；2)适应环境：将大鼠放在罩有透明塑料笼的智能冷热板上适应5 min，观察其探究活动，待其探究活动基本消失；3)检测：待大鼠适应环境后，开启仪器检测模式，观察并记录随后检测时间5 min内术侧后肢的抬足次数，由大鼠正常行动或体位变动所引起的抬足次数不计入内。

1.6.1.2 机械缩足反射阈值(paw withdrawal mechanical threshold，PWMT)检测

待CST检测结束后，采用电子机械测痛仪进行机械缩足反射阈值检测。1)适应环境：将大鼠置于底面为网格(0.5 cm×0.5 cm)的透明测试盒中，适应15～30 min，待大鼠探究活动消失；2)检测：将测痛仪探头移动至大鼠右后足底中央，持续增加压力，待大鼠出现抬足、舔足时记录仪器显示阈值，连续测量5次，每次测量间隔10 min。

1.6.1.3 热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency，TWL)检测

待PWMT检测结束后，采用热刺痛仪进行热缩足反射潜伏期检测。1)适应环境：将大鼠置于底面为玻璃三面黑色的测试盒中，适应15～30 min，待大鼠探究活动消失；2)设置参数：最长测试时间20 s，强度50%；3)检测：将红外探头移动至大鼠右后足底中央，开始检测，待大鼠出现抬足、舔足时记录仪器显示缩足反射潜伏期，连续测量5次，每次测量间隔10 min。

各组行为学测试结束后，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血6～8 mL，离心后取血清于-80 ℃保存；取L4-6DRG，于-80 ℃保存。

1.6.2 ELISA法检测血清中IL-10和TNF-α水平

根据试剂盒说明书检测各组血清中IL-10和TNF-α表达水平。

1.6.3 qPCR法检测L4-6DRG中TNF-α、TRPV1、TRPA1基因表达水平

采用Trizol试剂提取相应组织和细胞中总RNA，采用SweScript All-in-One RT SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Remover)试剂盒，根据说明书将RNA样本于普通PCR仪上逆转录为 cDNA，再根据 2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix试剂说明书荧光定量PCR仪上完成扩增反应。引物信息见表1。

表1 引物序列

1.7 统计学方法

本研究数据使用SPSS 25.0软件进行统计学分析。组间比较采用单因素方差(One-way ANOVA)方法进行分析，所有数据结果使用均数±标准差()表示。以P<0.05为差异有统计学意义；以P<0.01为差异有显著性统计学意义。

2、结果

2.1 行为学结果及分析

2.1.1 CST在推拿后6 h降低冷痛敏疗效最显著

见图1所示，在进行造模前，基线测试结果显示各组间差异无统计学意义(P>0.05)，说明可以进行后续实验检测。在进行造模后7 d，与假手术组进行比较，模型组和推拿各亚组显著上升(P< 0.05)，说明造模成功。干预后，与模型组比较，推拿各亚组均减少，其中推拿后6 h组抬足次数显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)。表明在早期推拿24 h内，推拿具有降低冷痛敏的作用，且在推拿后6 h降低冷痛敏疗效最显著。

2.1.2 PWMT在推拿后即刻至推拿后6 h、12 h、24 h疗效显著

见图2所示，在进行造模前，基线测试结果显示各组间差异无统计学意义(P>0.05)，说明可以进行后续实验检测。在进行造模后7 d，与假手术组进行比较，模型组和推拿各亚组显著上升(P<0.05)，说明造模成功。与模型组比较，推拿各亚组除推拿后18 h组外，PWMT明显高于模型组，其中推拿后即刻、6 h、12 h、24 h组显著高于模型组，且差异具有统计学意义(P<0.01)。表明在早期推拿24 h内，推拿能够有效降低机械痛敏，且在推拿后即刻至推拿后6 h、12 h、24 h疗效显著。

2.1.3 TWL在推拿后即刻疗效最显著

见图3所示，在进行造模前，基线测试结果线测试结果显示各组间差异无统计学意义(P>0.05)，说明可以进行后续实验检测。在进行造模后7 d，与假手术组进行相比，模型组和推拿各亚组显著上升(P<0.05)，说明造模成功。干预后，与模型组比较，推拿后推拿各亚组均增高，其中推拿后即刻明显增高，且差异具有统计学意义(P<0.05)。表明在早期推拿24 h内，推拿能够有效降低热痛敏，且在推拿后即刻疗效最显著。

图1 各组冷敏阈值（CST）结果

图2 各组机械缩足反射阈值（PWMT）结果

图3 各组热缩足反射潜伏期（TWL）结果

2.2 各组血清中IL-10、TNF-α变化情况

见图4。

2.2.1 推拿可降低血清中IL-10的表达而发挥镇痛作用

与模型组相比，推拿后6 h和推拿后24 h明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)，表明在早期推拿24 h内，推拿可通过降低血清中IL-10的表达而达到镇痛的作用。

2.2.2 推拿可降低血清中TNF-α的表达而发挥镇痛作用

与模型组相比，推拿后即刻(P<0.01)、推拿后6 h(P<0.01)和推拿后24 h(P<0.05)均有明显下降，推拿可通过降低血清中TNF-α的表达而达到镇痛的作用。

图4 各组血清IL-10和TNF-α的变化情况   

2.3 各组DRG中TNF-α、TRPV1、TRPA1基因表达变化情况

见图5、图6、图7。

2.3.1 推拿可降低DRG中TNF-α的基因表达而发挥镇痛作用

与模型组相比，推拿后5个时间点的TNF-α基因表达均有减少，其中推拿后6 h(P<0.01)、推拿后12 h(P<0.01)显著减少，差异均有统计学意义；与假手术组相比，模型组的TNF-α基因表达显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，表明在早期推拿24 h内，推拿可通过降低DRG中TNF-α的表达而达到镇痛的作用。

2.3.2 推拿可降低DRG中TRPV1的基因表达而降低热痛敏

与模型组相比，推拿后即刻(P<0.01)、推拿后6 h(P<0.05)、推拿后12 h(P<0.05)TRPV1基因表达明显减少，差异有统计学意义；模型组与假手术组比较，差异不具有统计学意义(P>0.05)，表明在早期推拿24 h内，推拿可通过降低DRG中TRPV1的表达降低由pNPP引起的热痛敏，从而达到镇痛的作用。

2.3.3 推拿可降低DRG中TRPA1的基因表达而降低冷痛、机械痛敏

与模型组相比，推拿后5个时间点的TRPA1基因表达均有明显减少，其中除推拿后18 h为P<0.05，其余4个时间点均为P<0.01，差异均有统计学意义；与假手术组比，模型组的TRPA1基因表达显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，表明在早期推拿24 h内，推拿可通过降低DRG中TRPA1的表达降低由pNPP引起的冷痛、机械痛敏，从而达到镇痛的作用。

图5 扩增曲线  

图6 熔解曲线

图7 各组DRG内TNF-α、TRPV1、TRPA1基因表达变化情况(，n=7)

3、讨论

研究通过minor CCI模型模拟临床坐骨神经损伤导致的pNPP，形成稳定的慢性疼痛后，给予推拿1次干预后通过行为学检测疼痛变化、分子生物学检测相关蛋白基因的变化，进一步验证了推拿具有即刻镇痛作用，且针对不同的伤害性感受具有不同的疗效显著时间点，为下一步推拿镇痛启动机制研究提供了有效支撑。

3.1 研究采用CST、PWMT、TWL作为指标以探究推拿针对不同伤害感受的疗效

pNPP的临床表现中诱发痛主要包括痛觉过敏(hyperalgesia)和痛觉超敏(allodynia)，即冷热刺激诱发痛和机械触觉诱发痛[3]，目前对此两种痛觉的经典量化行为学研究指标就是CST、PWMT、TWL。在CST中，冷板实验(cold-plate test)，即本次实验中所用ZH-6C智能冷热板测痛仪，较为客观，受周围环境因素影响小，温度恒定，精密度高[4]。在基础研究中常用Von Frey纤维丝估算PWMT[5]，是评价神经病理性疼痛的经典指标之一，主要针对机械刺激产生的针刺痛觉，以评估啮齿类动物的机械触觉诱发痛。而在哈格里夫斯实验(Hargreaves test)中，对啮齿类动物是采用热刺痛仪检测以评估其对热痛敏的反应，应用于神经损伤后疼痛敏感化或热痛反应恢复的评价[6]，用以对啮齿类动物后足是否因热度而产生缩足反应进而被仪器检测到其后足移动进行观察，若产生移动，控制器将感应到而自动关闭红外线并停止计时，也就是TWL[7]。实验表明minor CCI 模型大鼠对TWL的敏感性最优[8]。因此，此次对minor CCI 模型大鼠行为学的量化研究方法就是采用冷板实验、电子机械刺痛仪以及热刺痛仪进行检测。

3.2 早期推拿干预后对不同伤害性感受的疗效显著时间点不同

目前推拿镇痛作用的临床疗效以及机制研究已进行了初步的探索，团队前期研究主要是对推拿一定次数后镇痛机制方面，近两年对推拿初期镇痛机制进行了研究，以探明推拿镇痛是如何启动的。此次研究采用“三法三穴”对minor CCI模型大鼠干预1次后，选取5个时间点进行CST、PWMT、TWL检测，观察CCI模型大鼠的温度觉和机械触觉的变化情况。结果发现推拿干预1次后，与模型组相比，均在即刻有所改善，再一次验证了前期研究结果，即推拿有即刻镇痛效果。但是针对不同性质的痛觉，镇痛疗效显著的时间点并不相同。在CST方面，推拿后6 h有统计学意义；在PWMT方面，推拿后即刻、6 h、12 h、24 h具有统计学意义。在TWL方面，推拿后即刻有统计学意义；表明推拿镇痛效果能够持续的同时，在针对冷刺激诱发痛和机械触觉诱发痛的疗效显著时间点有所延迟，针对有害热刺激诱发痛方面即刻有效且疗效更为显著、更为持久。

3.3 CST检测可能影响机械缩足反射阈值PWMT检测

在先后进行CST、PWMT、TWL检测时需适当延长给予大鼠休息时间，否则影响下一种行为学检测结果。与前期关于推拿干预后即刻镇痛检测结果相比，此次研究行为学的检测顺序是CST、PWMT、TWL，开始在检测CST结束后给予大鼠的休息时间仅约15 min，在进行PWMT时大鼠的敏感性与前期研究仅做PWMT时相比较差，推测可能是由于大鼠在CST检测后休息时间较短，大鼠的冷觉还没有恢复，影响了机械触觉，进而影响了PWMT检测结果。因此，此后实验中如需先后进行CST、PWMT、TWL三种行为学检测，需适当延长两种行为学检测之间的间隔时间，避免影响大鼠感觉恢复从而影响检测结果。

3.4 早期推拿干预后可有效降低血清中IL-10、TNF-α的表达

炎性介质在疼痛的产生中发挥重要作用，可以引起外周及中枢敏化，使伤害性感受器对敏感性增强[9]。IL-10、TNF-α作为重要致炎因子，通过调控上下游各通道、细胞因子等参与pNPP的产生与维持[10]。本研究通过对干预后minor CCI模型大鼠血清中IL-10、TNF-α的表达水平变化检测发现，与模型组相比，IL-10在推拿后6 h和推拿后24 h明显下降；TNF-α在推拿后即刻、推拿后6 h和推拿后24 h均有明显下降。通过对干预后minor CCI模型大鼠DRG内TNF-α基因表达水平变化的检测发现，与模型组相比，推拿后5个时间点的TNF-α基因表达均有减少，其中推拿后6 h、推拿后12 h显著减少；表明早期推拿干预后可通过降低IL-10、TNF-α等炎性因子的表达发挥镇痛作用而减轻疼痛。

3.5 早期推拿干预后可有效降低DRG内TRPV1、TRPA1基因的表达

TRPV1、TRPA1为 TRP 家族中典型的有害热、冷、机械刺激的离子通道，早期推拿干预后可明显降低DRG内TRPV1、TRPA1基因的表达。当外周神经伤损后，受损的神经纤维和 DRG 神经元胞体膜上相关离子通道出现细胞外钙离子内流增加，使细胞内钙离子浓度增高，神经纤维和神经元处于兴奋状态，降低了刺激阈值，引起异位放电，导致自发性疼痛、痛觉过敏、痛觉超敏[11]。在神经损伤引起的 pNPP中，热超敏反应多取决于TRPV1通道，而冷和机械超敏反应多取决于TRPA1通道。本次研究通过对minor CCI模型大鼠推拿1次后不同时间点DRG内TRPV1、TRPA1基因表达水平的检测，结果发现与模型组相比，推拿后即刻、推拿后6 h、推拿后12 hTRPV1基因表达明显减少；推拿后5个时间点的TRPA1基因表达均有明显减少，表明推拿后即刻启动镇痛，推拿早期干预可通过降低TRPV1、TRPA1的表达而发挥镇痛作用。

参考文献:

[1]李明珠,王文萍,金圣博.奥沙利铂诱导的神经病理性疼痛大鼠模型研究及其在中医方面应用进展[J].中国实验动物学报,2020,28(2):278-285.

[2]王厚融,刘志凤,于天源,等.Minor CCI 与经典 CCI 大鼠模型成模特点的比较研究[J].中国比较医学杂志,2022,32(10):1-7.

[10]汪小芳,何苏月,马卓琳,等.大鼠 DRG 内 ClC-3敲减导致的 TNF-α/IL-10 失衡对电压门控性钠通道表达和机械痛敏的影响[J].中国病理生理杂志,2020,36(7):1153-1160.

基金资助:国家自然科学基金项目(82074573,82274675); 北京自然科学基金项目(7232278);

文章来源:杨震杰,萨出拉,于天源,等.早期推拿后大鼠24 h内疼痛变化特点的研究[J].长春中医药大学学报,2024,40(07):740-745.