摘要: 探讨尖端赛多孢子菌感染的实验室检查特点及临床治疗方案。方法 回顾本院收治的1例因右膝外伤术后导致尖端赛多孢子菌感染患者的临床资料,总结对尖端赛多孢子菌感染的实验室检查进行分析。收集并整理各例尖端赛多孢子菌感染相关的临床治疗方案。结果 临床标本直接镜检均可见真菌菌丝。尖端赛多孢子菌在沙堡弱葡萄糖琼脂培养基(或者科玛嘉显色培养基)上,25℃、5%CO2环境培养时,生长较迅速,起初菌落呈现白色棉絮状,经培养数天后,可见菌落中央逐渐变成褐色,且不断向四周扩散。同时结合乳酸酚棉蓝染色后的镜下形态特征、质谱分析或基因测序等检测方法对该菌进行快速鉴定。结论 尖端赛多孢子菌所致感染在临床上较为罕见,但因其病程较长,诊断困难,所以分析尖端赛多孢子菌感染的实验室检查特点和临床治疗方案,以加强临床和实验室对由尖端赛多孢子菌感染引起的各种疾病的认识,减短鉴定时间,提高诊治水平,降低患者死亡率。
尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiospermum)是一种少见的具有较强侵袭性和致病性的条件致病腐生真菌,属波氏假阿利什菌的无性型,广泛存在于自然界,如污水、湿地、咸水、腐物等被污染的环境中[1],也可以从篮球场、农田、污水灌溉的土壤和植物、城市公园等与人类生活息息相关的地方中分离出来[2]。一般情况下对人或动物不致病,但易引起艾滋病、血液系统相关的恶性疾病、器官移植以及长期应用糖皮质激素或免疫抑制剂等免疫力低下的患者感染,也可发生于外伤、骨髓炎、肺炎、关节炎、污水淹溺、眼部感染等免疫功能正常者[3,4],且感染率呈逐渐上升趋势。这种真菌所致的深部感染可以局部化,延伸到周围组织或传播到远处的器官,甚至是播散全身[5]。目前,尖端赛多孢子菌感染在临床比较罕见,医护人员对该菌所致感染的临床表现特征和其形态学特点还不够熟悉,实验室检查鉴定耗时较长。同时该菌对多种抗真菌药物耐药[6,7],给临床医生的治疗带来了巨大挑战。
1、资料与方法
1.1资料
患者,杨某,男,42岁。因“右膝外伤术后3个月伴红肿2个月”入院。患者3个月前因外伤导致右膝疼痛,活动受限,伴皮肤破裂出血,余肢体无活动受限,来本院诊断为右膝多发皮肤挫裂伤,神经断裂,予入院清创缝合治疗。术后恢复。2个月前无明显诱因下出现右膝红肿,持续疼痛明显,伴行走困难。曾去上海某医院就诊,MRI示关节积液较低,为求进一步诊治,遂来本院,拟“右膝挫裂伤术后伴右膝滑膜炎”予收住入院。辅助检查:电解质+肝肾糖(住院):白蛋白34.3 g/L;超敏C-反应蛋白+血常规:血红蛋白108.0 g/L,血小板442.0×109/L,超敏C-反应蛋白84.7 mg/L;凝血功能+D二聚体:D二聚体3.54 mg/L,纤维蛋白原8.21 g/L;血沉:红细胞沉降率108 mm/1 h;降钙素原测定未见明显异常。治疗上,前期予头孢+左氧抗炎治疗,及关节腔清理冲洗引流术,但右膝肿胀疼痛等不适症状未见好转,彩超定位下行关节腔穿刺抽液,进行一般细菌及真菌培养。
1.2仪器与试剂
全自动快速生物质谱检测系统(Bruker Micro FlexTM MALDI-TOF-MS Bio TyperTM,德国布鲁克);全自动微生物分析系统(VITEK 2 Compact,法国梅里埃);隔水式电热恒温培养箱(HGPN-32,中国上海跃进);全自动血培养仪(BD BACTEC TMFX400,美国BD公司);低速台式自动平衡离心机(SC-3612,中国安徽中科中佳);尼康显微镜(E200,日本尼康)。甲酸;MALDI-TOF-MS基质和溶液系统;念珠菌筛选显色培养基(批号:180315);哥伦比亚血琼脂培养基(批号:180320-2);10%KOH溶液(KOH和水的质量按照1:9配制)。
1.3方法
1.3.1标本采集与直接镜检
于2018年10月22日超声引导下行膝关节腔积液穿刺引流术,多次采集适量引流液送检。将上述标本离心后直接涂片,用10%KOH溶液湿片镜检。
1.3.2微生物的分离培养
于2018年10月22日多次采集患者膝关节腔积液,在无菌条件下,取各标本5 ml~10 ml,注入血液培养瓶内,充分混匀,置BD BactecTMFX400血液培养箱培养。用5 ml一次性注射器从阳性报警的需氧瓶中抽取少许培养液,以四区分段划线法转种于哥伦比亚血琼脂平板(BA)、麦康凯平板(MAC)和念珠菌显色平板,置35℃、5% CO2环境中培养,以形成单个菌落或分离出单一菌株。观察各平板所生长菌落的形态特征及变化。
1.3.3染色镜检
为进一步观察显微镜下真菌的形态特征,取上述培养基中培养出的部分菌落置洁净载玻片上,滴加乳酸酚棉兰染液,加上盖玻片后镜检。
1.3.4质谱分析
应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)对以上检出的真菌进行鉴定,获取真菌全细胞蛋白(主要是核糖体蛋白)质谱,通过与数据库中已知菌质谱进行比较、分析,获得鉴定结果。
1.3.5临床治疗方案
本例患者的医疗组决定在使用药物治疗的情况下筛选合适的消毒剂冲洗关节腔。选用0.3%聚维酮碘(皮肤黏膜消毒)和PHMB(环保型高分子聚合物消毒剂)。设置以下实验组:阴性对照(空白平板对照,蒸馏水,硫代硫酸钠);阳性对照(0.5麦氏浓度菌液);上述2种消毒液的使用浓度分别稀释1倍~5倍后加入等量0.5麦氏浓度菌液作用30 min后接种于念珠菌显色平板(聚维酮碘组分别加入等量0.1%硫代硫酸钠中和后接种)。阴性对照、0.3%聚维酮碘和PHMB分别处理过的菌液培养5 d均为阴性;而阳性对照真菌生长良好。实验证明0.3%聚维酮碘和PHMB对尖端赛多孢菌均有较强的杀菌作用。故拟定治疗方案(于2018年11月15日开始实施):(1)口服伏立康唑(200 mg q12h),视患者情况逐渐增大剂量;(2)0.3%聚维酮碘灌洗关节腔作用30 min后生理盐水持续冲洗引流。
2、结 果
2.1标本直接镜检
引流液肉眼可见血性浑浊,有大量絮状组织,离心后直接涂片,显微镜下可见真菌菌丝。
2.2微生物的分离培养
经一段时间培养后,需氧瓶培养结果均显示阳性,培养瓶内肉眼可见白色絮状小球。将阳性需氧瓶中的培养液转种于BA平板上,培养48 h后可见白色棉絮状菌落(图1)。转种于MAC平板上,无菌落生长。转种于念珠菌显色培养基上35℃生长较慢,25℃孵育生长较快,菌落起初为白色向四周扩展,其后中心由白色逐渐转为淡褐色,边缘呈灰白色毛绒状(图2)。
图1 BA平板培养48 h后可见白色棉絮状菌落
图2显色培养基上菌落生长特征
2.3染色镜检
经乳酸酚棉蓝染色后,真菌被染成蓝色,镜检可见具有分隔、菌丝较粗,分生孢子梗侧生或顶生,梗端着生单个分生孢子,为环痕产孢,有时可产生多个分生孢子(图3)。
图3镜检染色(乳酸酚棉蓝,×400)
2.4质谱分析
通过与数据库中已知菌质谱进行比较、分析,获得质谱鉴定结果,为Scedosporium-apiosprrmum[ana]Pseudallescheria-boydii[teleo]2008-161439 MUZ (尖端赛多孢)。
2.5临床治疗结果
2018年11月21日,肉眼可见引流液清澈,后续持续镜检和培养未见细菌及真菌生长。随后拔除引流管,提高抗菌药物血药浓度。患者经上述治疗后,辅助检查可见,超敏C-反应蛋白和红细胞沉降率日趋下降直至正常水平,见表1。2018年12月29日,患者一般情况好,自诉右膝无明显疼痛,无四肢麻木,无畏寒发热等不适,查体:神清,精神可,右膝肿胀不明显,压痛不明显,右下肢敷料干洁,无明显渗出,足趾活动良好,予以出院,经过3年常规随访,患者痊愈。
表1超敏C-反应蛋白和红细胞沉降率结果
3、讨 论
近年来,尖端赛多孢子菌感染在临床上的检出率呈逐年上升趋势,该菌属于侵袭性丝状真菌,极易引起免疫缺陷或免疫功能低下患者的严重感染。由多个病例报道可见,免疫功能正常患者的感染率也明显增多[8],可能的原因有:(1)外伤或手术过程中机体的外环境暴露;(2)治疗过程中没有有效的抑制真菌感染等。由于尖端赛多孢子菌所致感染的真菌形态学特点与临床特征和镰刀霉病、曲霉病及其他相对较为常见的透明丝孢霉病十分相似,且其临床表现根据个体和感染部位的不同也不尽相同,易出现误诊而未能进行及时、有效的治疗[9]。因此,需要通过真菌培养的菌落特性、染色后镜下的形态学特点、质谱分析和基因测序等鉴定方法来明确诊断。
临床治愈率逐渐增加的关键原因在于抗菌药物的正确选用及用药浓度的筛选。有研究结果显示[10,11,12,13],伊曲康唑、氟康唑、酮康唑、两性霉素B、特比奈芬和制霉素等多种体外敏感性及治疗特点现行的抗真菌药物对尖端赛多孢子菌的抑菌活性较差,并不适用于治疗尖端赛多孢子菌感染。有试验结果表明[10],在体外单独用药时,伏立康唑对尖端赛多孢子菌的最低抑菌浓度(MIC)值低于两性霉素B和伊曲康唑,说明抗真菌药物在单独应用时,伏立康唑具有更好的抗菌活性;卡泊芬净的抑菌浓度较高,在浓度较低时,仅引起尖端赛多孢子菌菌丝变短畸形;但卡泊芬净和伊曲康唑的联合用药可以使两药的MIC值均降低,故可在较低药物浓度下,有效发挥抗真菌作用。而本患者的治疗中,选用合适的消毒剂(0.3%聚维酮碘)处理感染部位,可以直接杀灭大量该菌;联合伏立康唑,在加快患者康复中起到重要作用,此种方法是否可以广泛推广,还需更多的临床病历来支持。
虽然目前临床常使用的抗真菌类药物治疗尖端赛多孢子菌有效[14],如伏立康唑、普沙康唑、雷夫康唑、卡泊芬净等,但是其最佳用药剂量和周期等依旧无明确、统一的标准。实验室需要对临床分离菌株进行体外抗真菌药物敏感试验,筛选具有针对性的抗真菌药物及其用药剂量、疗程,使患者得到有效的治疗。尽管有新的三唑类如泊沙康唑和艾沙康唑的出现,它们似乎没有提供比伏立康唑治疗由尖端赛多孢子菌所致感染更显著的治疗进展。因此,需要深入研究,比如建立侵入性尖端赛多孢子菌的实验药效学模型,以优化当前的抗真菌药或开发更新的抗真菌药[15],为临床提供更加及时、有效的治疗方案,降低患者死亡率。
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文章来源:辛少军,沈翠芬,汪艳等.1例外伤引起的尖端赛多孢菌感染的实验室检查及探索性临床治疗[J].中国卫生检验杂志,2023,33(19):2343-2346.
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