诺如病毒（norovirus,No V）作为近年来全球范围内导致腹泻和呕吐性急性胃肠炎的主要病因，具有极高的传染性，可通过粪口途径直接在人与人之间迅速传播，或间接通过接触污染物或食用受污染的食物或水等方式传播，具有很高的流行率和病死率[1-6]。作为杯状病毒科的无包膜单链正链RNA病毒，其基因组分为3个开放阅读框（open reading frame,ORF)[7-8]。ORF1编码病毒非结构蛋白，ORF2编码病毒主要衣壳蛋白（VP1),ORF3编码病毒次要衣壳蛋白（VP2)[9]。诺如病毒被分为10个基因组（GI-GX），并根据主要衣壳蛋白VP1的氨基酸序列不同进一步分为48种基因型，其中GⅠ、GⅡ、GⅣ、GⅧ和GⅩ以人类作为宿主[10]。目前尚无针对该病毒的特效药及疫苗，因此，快速检测和识别No V对于维护公共卫生安全极为重要[11]。

目前在病毒快速诊断试剂研发过程中存在缺乏特异性抗原等问题，导致在检测中出现因病毒快速变异，造成多种不同基因型病毒的漏检，降低检测准确度，减弱实际应用效果，是相关领域内亟待解决的难点，因此通用型抗原的研究显得尤为重要和急迫。

基于此，本研究拟采用生物信息学方法筛选构建No V多表位抗原序列，经二级结构、理化性质分析及免疫评估，通过大肠杆菌原核表达系统制备重组蛋白并鉴定，经动物免疫制备单克隆抗体并在胶体金平台初步应用，验证多表位抗原构建思路的可行性及抗原的实际应用价值，以期为后续No V通用型检测靶点探究及诊断原材料开发提供参考，为后续其他同类病毒抗原构建及疫苗研发提供借鉴。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

SPF级BALB/c小鼠11只，体质量18～25 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2021-006。饲养标准：温度20～26℃，空气湿度50%～70%；亮12 h暗12 h循环。本研究经河南省生物工程技术研究中心实验动物伦理委员会批准（DWLL2021005）。

1.1.2实验试剂

大肠杆菌表达菌株BL21(DE3）、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记的兔抗小鼠Ig G（兔抗鼠-HRP）、His-tag抗体由河南省生物工程技术研究中心保存；Ni-NTA亲和层析填料购自通用电气（GE）公司；酵母粉、蛋白胨购自OXOID公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）干粉、二氨基联苯氨（DAB）显色液、RPMI-1640购自上海索莱宝生物科技有限公司；PEG1450、HAT、HT购自Sigma-Aldrich公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1 No V多表位抗原序列的筛选合成

利用NCBI数据库检索诺如病毒GⅠ型、GⅡ型毒株序列。选取100株国内外流行No V的VP1蛋白序列，通过DNAMAN进行多序列比对分析，筛选保守性序列位点。以No V GⅠ.3、GⅡ.4 VP1蛋白基因序列（Gen‑Bank:AWR17825.1、Gen Bank:AFV08795.1）为模板，确定保守序列氨基酸组成。使用SWISS-MOD‑EL构建模板蛋白三维结构，预测保守序列在模板蛋白中的位置。ABCpred预测模板蛋白B细胞表位，阈值设为0.51[12-13]。对比保守序列与预测B细胞表位的差异性，筛选位于蛋白结构表面、高度保守的表位序列。

使用柔性连接子“SGGGGS”作为linker顺位连接筛选出的序列，构建No V多表位抗原序列，命名为“诺如病毒组合抗原”，简称No V-ZH。

使用Expasy-Prot Param、PSIPRED、SOPMA在线工具分别对多表位抗原理化性质及二级结构进行分析，通过C-IMMSIM对所设计的抗原进行抗原免疫应答评估，快速评估抗原的免疫原性。

将确定好的序列交由深圳华大基因股份有限公司合成，经大肠杆菌密码子优化后分别与p ET-28a（+）载体、p ET-32a载体连接构成诺如病毒组合抗原1(No V-ZH1）、诺如病毒组合抗原2(No V-ZH2）。

1.2.2 No V-ZH重组蛋白制备及鉴定

抗原序列交由华大基因经大肠杆菌密码子优化后连接到p ET-28a（+）、p ET-32a载体的Bam HⅠ和XhoⅠ两个酶切位点之间，表达出的蛋白利用p ET-28a（+）载体140～157位、641～658位His标签，p ET-32a载体140～157位、698～715位His标签进行纯化。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3）感受态细胞。活化后接种到含有卡那霉素（50μg/ml）的LB培养基中，37℃、210 r/min培养至菌液OD600为0.8时，使用终浓度0.4 mmol/L的IPTG诱导表达6 h,8 000 r/min、10 min离心收菌。

包涵体蛋白菌体用20 mmol/L Tris-HCl(p H=8.0）重悬，超声破碎，8 mol/L尿素缓冲液溶解，离心收集上清。过滤后用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化，100 mmol/L咪唑、300 mmol/L咪唑进行洗涤，洗脱下的蛋白进行SDS-PAGE电泳检测[14]。收集洗脱液装入透析袋，4℃条件下用不同浓度梯度的尿素缓冲液搅拌复性，每6 h更换1次透析液，共3次。

可溶性蛋白菌体用20 mmol/L磷酸缓冲液（p H=8.0）重悬，超声破碎，离心收集上清，用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化，20 mmol/L咪唑、100 mmol/L咪唑以及200 mmol/L咪唑洗脱蛋白，并进行SDS-PAGE电泳检测。

选取SDS-PAGE电泳检测条带单一、大小正确、纯度高的蛋白进行Western blotting鉴定。SDS-PAGE电泳后，100 V冰浴转膜90 min,PBST清洗，5%脱脂奶粉封闭2 h，使用一抗孵育2 h,PBST清洗，二抗孵育2 h,PBST清洗，DAB显色。

1.2.3 No V单克隆抗体的制备及鉴定

1.2.3.1动物免疫及效价检测

使用No V-ZH2重组蛋白与弗式佐剂等体积乳化免疫BALB/c小鼠，每只免疫50μg抗原，间隔14 d免疫1次。免疫3次后，使用No V-ZH1蛋白作为检测抗原，检测小鼠血清效价。将收集的免疫鼠血清倍比稀释，向No V-ZH1抗原包被板每孔加入100μl,37℃孵育30 min,PBST洗5次，拍干。每孔加入兔抗鼠Ig G-HRP(1∶1 500)100μl,37℃孵育30 min,PBST洗5次，拍干。加入显色液A液和B液各50μl,37℃孵育20 min。每孔加入50μl终止液。使用全波长酶标仪（450 nm,630 nm）读数，效价达到1∶8 000即可进行细胞融合。

1.2.3.2细胞融合及单抗制备

融合前3 d，按照每只小鼠100μg的剂量进行免疫冲击。融合时，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞，按10∶1比例在聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）作用下进行细胞融合。

融合4 d后，使用HAT培养液进行半定量换液，7 d后全换液，11～13 d取细胞上清液，使用间接ELISA法进行效价检测，选择单个细胞团的阳性孔按照有限稀释法亚克隆3次，选择阳性较强且生长状态良好的单克隆杂交瘤细胞进行保存。

将阳性单克隆杂交瘤细胞注入预先注射液体石蜡的小鼠腹腔，待小鼠腹部隆起变黑时，取出腹水。经辛酸-硫酸铵法纯化获得单克隆抗体，并对单抗进行SDS-PAGE电泳鉴定，电泳样品上样缓冲液中不含巯基乙醇。同时将抗原各组成片段交由生工生物工程合成多肽，偶联载体蛋白后，制备ELISA检测包被板，采用间接ELISA法，参照1.2.3.1中效价检测方法对制备出的单抗进行鉴定。

1.2.3.3配对抗体筛选及Western blot鉴定

使用过碘酸钠（Na IO4）法对单抗进行HRP标记。将单克隆抗体以100 ng/孔加入酶标检测板，4℃过夜后弃去包被液，PBST洗涤1次，每孔加入150μl封闭液，37℃封闭2 h，弃去孔中液体，拍干。以100μl/孔的体积加入No V-ZH1抗原，作为阳性样本，37℃温育30 min,PBST洗板5次，拍干。加入HRP标记的单克隆抗体（1∶2 000稀释），37℃温育30 min,PBST洗板5次，拍干。依次向孔内加入显A、显B各50μl,37℃温育20 min，加入50μl终止液，酶标仪双波长检测[14]，参数设为430 nm、650 nm。计算P/N值，最高者为最佳配对单抗。

No V-ZH1抗原经SDS-PAGE电泳后，100 V冰浴转膜90 min,PBST清洗，5%脱脂奶粉封闭2 h，使用No V单抗（1∶2 000)4℃孵育过夜，PBST清洗，兔抗鼠-HRP孵育2 h,PBST清洗，DAB显色。

1.2.4 No V单克隆抗体初步应用

单抗鉴定后制备胶体金检测试纸条，并对其灵敏度和特异度进行鉴定。将制备的室内参考品从2 ng/ml进行倍比稀释，使用试纸条进行检测，评价其检测灵敏度。使用参考品和河南省生物工程技术研究中心提供的No V-GⅠ重组衣壳蛋白、No V-GⅡ重组衣壳蛋白、A型轮状病毒裂解液、肠道腺病毒40型（Adenovirus40,Ad 40）裂解液、No V-ZH1蛋白进行检测，对试纸条特异性进行鉴定。

2、结果

2.1抗原序列筛选

通过DNAMAN进行比对，筛选出6个保守性序列片段，以No V GⅠ.3、GⅡ.4 VP1蛋白序列为模板，确定保守序列氨基酸组成。其中，比对得到的保守片段85～102 aa，与GⅠ.3 VP1蛋白85～102 aa存在第94位、第97位氨基酸的差异，选择保留保守片段85～102 aa(GⅠ-4）作为表位抗原构建的一部分（表1）。

SWISS-MODEL构建的GⅠ.3、GⅡ.4 VP1蛋白三维结构结果显示，以两种蛋白为模板确定的保守序列位于蛋白结构外侧（图1）。ABCpred预测No V GⅠ.3、GⅡ.4 VP1蛋白B细胞表位的结果显示，与筛选出的保守片段存在交叉重叠，保守片段存在GⅠ.3、GⅡ.4 VP1蛋白B细胞表位的可能性（表2、表3）。

使用柔性连接子“SGGGGS”顺位连接筛选出的序列，构成No V多表位抗原序列No V-ZH。

2.2 No V-ZH的二级结构和理化性质

由预测结果可知，在No V-ZH二级结构组成中，α螺旋、β折叠分别占比23.13%、9.70%，无规卷曲占比53.73%（图2）。理论分子质量为13.1 ku，理论等电点（PI）为7.16；水溶性总平均值为-0.175(<0），负值的绝对值越大，亲水性越好，表明该抗原为亲水性蛋白，较易溶于水溶液，适合作为抗原。

表1 多表位抗原序列筛选

2.3 No V-ZH抗原免疫应答刺激评估

使用C-IMMSIM对所设计的抗原进行抗原免疫应答刺激评估，结果显示，随着免疫次数增加，各种类型记忆B细胞滴度不断增加，非记忆B细胞减少（图3A),B淋巴细胞群被不断激活（图3B、C）。在第2次和第3次免疫后，抗体滴度显著增加（图3D),Th细胞和Tc细胞状态被激活（图3E、F），可诱导高细胞因子分泌（图3G），确定目的抗原刺激机体后符合诱导免疫应答规律，具有良好的免疫原性，可激活体液免疫应答和细胞免疫应答。

图1 SWISS-MODEL获得GⅠ.3、GⅡ.4 VP1蛋白模型展示

表2 GⅠ.3 VP1蛋白B细胞表位预测

表3 GⅡ.4 VP1蛋白B细胞表位预测

2.4 No V-ZH重组蛋白制备及鉴定

取诱导前后No V-ZH1菌液进行电泳，结果如图4显示，M为Marker,1为No V-ZH1诱导前沉淀，2为No V-ZH1诱导后沉淀，3为No V-ZH1破碎后沉淀，4为No V-ZH1破碎后上清。由图可知，No V-ZH1菌液诱导后沉淀较诱导前出现1条约17.9 k D的条带，且破碎后的沉淀中出现同等大小的条带，表明成功表达了No V-ZH1蛋白，且蛋白以包涵体形式表达。

同样地，取诱导前后No V-ZH2菌液进行电泳，结果如图5显示，M为Marker,1为No V-ZH2诱导前沉淀，2为No V-ZH2诱导后沉淀，3为No V-ZH2破碎后沉淀，4为No V-ZH2破碎后上清。由图可知，No V-ZH2菌液诱导后沉淀较诱导前出现1条约33.9 k D的条带，且破碎后的上清中出现同等大小的条带，No V-ZH2蛋白表达成功，且蛋白可溶性表达。

经Ni-NTA亲和层析纯化后，电泳结果如图6所示，M为Marker,1和2同为No V-ZH1在300 mmol/L咪唑条件下的洗脱产物，3为No V-ZH1经梯度透析复性后的蛋白，4为No V-ZH2蛋白在100 mmol/L咪唑条件下洗脱产物，经SDS-PAGE电泳鉴定，两种蛋白的条带与预期大小一致，蛋白纯化较好。

免疫印迹分析结果显示，No V-ZH1/No V-ZH2重组蛋白与His-Tag抗体反应后，在17.9 k D及33.9 k D左右出现的特异性目标条带与预期蛋白分子质量大小相符（图7）。

图2 PSIPRED预测No V-ZH二级结构

2.5 No V单克隆抗体制备及初步应用

对比No V-ZH1蛋白，No V-ZH2无需复性，且分子量较大，在免疫时更易刺激机体产生免疫反应，因此选择No V-ZH2作为免疫原进行动物免疫。

取免疫后小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，进行3次亚克隆后获得5株阳性杂交瘤细胞株，进行腹水制备。腹水经辛酸硫酸铵法纯化后进行SDS-PAGE，结果如图8所示，电泳结果表明制备出的抗体纯度达到90%。

图3 No V-ZH抗原免疫应答刺激评估

图4 No V-ZH1蛋白表达及可溶性分析结果

图5 No V-ZH2蛋白表达及可溶性分析结果

图6 No V-ZH1、No V-ZH2重组蛋白纯化复性

图7 No V-ZH重组蛋白与His单抗Western blot鉴定结果

图8 单克隆抗体纯化结果

图9 单抗与不同多肽片段反应性鉴定

基于ELISA双抗体夹心法进行配对抗体筛选，结果显示，8B9、5F7为配对抗体（表4）。

取No V-ZH1蛋白进行Western blot检测，以8B9、5F7单抗作为一抗，兔抗鼠HRP为二抗，结果如图10所示，条带1以5F7作为一抗，条带2以8B9作为一抗，可见17.9 k D处有明显条带，表明两株单抗均与重组蛋白有良好反应性。

以鉴定后的8B9作为检测抗体、5F7作为包被抗体，制备胶体金检测试纸条，检测倍比稀释的No V-ZH1重组蛋白，结果如图11所示，条带1～4分别为2 ng/ml、1 ng/ml、0.5 ng/ml、0.25 ng/ml检测结果，试纸条最低可检测到0.5 ng/ml。

对试纸条的特异性进行鉴定，结果如图12所示，1～6分别为No V GⅠ重组衣壳蛋白、No V GⅡ重组衣壳蛋白、A型轮状病毒裂解液、肠道腺病毒40型病毒裂解液、No V-ZH1重组蛋白（阳性对照）、0.01 mol/L PBS（阴性对照）的检测结果。试纸条能特异性结合No V-ZH1重组蛋白（阳性对照）、No V GⅠ重组衣壳蛋白、No V GⅡ重组衣壳蛋白，但与A型轮状病毒裂解液、肠道腺病毒40型裂解液以及阴性对照均不反应，证明该试纸条具有良好的特异性。

表4 双抗体夹心ELISA配对抗体筛选结果

图1 0 5F7、8B9免疫印记鉴定结果

图1 1 No V抗原胶体金试纸条灵敏性分析结果

图1 2 No V抗原胶体金试纸条特异性分析结果

3、讨论

抗原制备属于单抗研发流程中关键的一环，抗原制备的好坏，决定抗体的产生及质量，相继影响后续检测方法的建立以及检测效果。目前，借助生物信息学分析蛋白质已成为抗原研究的有效手段，通过前期蛋白质相关性质及参数分析，可为进一步的实验提供信息，辅以后期的实验论证，可提高相关研究的工作效率。

本研究通过生物信息学方法设计诺如病毒多表位抗原No V-ZH。无规卷曲作为蛋白质的柔性元件，通常为抗原表位存在区域，本研究在No V-ZH二级结构分析结果中发现，无规卷曲占比较高，增加了构成No V-ZH的序列片段为抗原表位的可能性。α螺旋、β折叠则在No V-ZH二级结构中散在分布，为蛋白的刚性支撑部分。水溶性总平均值为-0.175(<0），负值的绝对值越大，亲水性越好，反之则表示疏水性强，表明No V-ZH适合作为抗原。免疫评估结果发现，随着免疫次数的增加，机体产生了更强的免疫反应，Ig M与Ig G滴度显著增加，不同类型记忆B细胞增加及非记忆B细胞减少，T细胞群激活，体液免疫应答和细胞免疫应答被逐渐激活。

本研究制备的两种蛋白分别以可溶性蛋白、包涵体蛋白的形式表达，能与His抗体反应，表明重组蛋白表达正确。通过鉴定5株单抗与抗原各组成部分多肽片段的反应性表明，141～153 aa与180～188 aa可能为抗原组成中的优势片段，对比剩余片段具有更强的免疫原性。使用筛选出的2株配对单抗，借助胶体金技术制备的试纸条灵敏度达0.5 ng/ml，可特异性结合两种病毒基因型No V重组衣壳蛋白。

单克隆抗体在诊断试剂研发中存在灵敏度高、特异性强、交叉反应少的特点，而免疫原在一定程度上影响单抗的质量。实验结果表明，构建的包含多种病毒基因型表位的抗原，反复刺激机体产生的单克隆抗体，在不同基因型病毒之间存在交叉反应性，可有效应对病毒基因不断变异所造成的免疫逃避及漏检问题。同样地，使用多个基因簇变异株联合免疫的方式也可得到类似效果[15]，但联合免疫时所需抗原数目众多，需反复进行抗原制备，较为不便，且制备出的抗体在进行鉴定及筛选时工作量较大，不利于实现诊断原材料工业化生产。

本研究结果证明在深入研究病毒抗原及进一步研发诊断试剂的过程中，除全病毒、病毒衣壳蛋白全长外，还可通过串联表位序列构建多表位抗原，增加抗原的特异性及广泛交叉反应性。本研究制备的多表位抗原可节省抗原制备的时间，为后期抗体筛选及鉴定过程提供便利，为后续No V抗体制备以及快速诊断试剂、快速分型检测试剂的研究和发展提供理论依据和生物学材料。

参考文献:

[12]曹钰婷,吴雪晗,宁钰,等.基于免疫信息学技术的结核分枝杆菌多表位疫苗构建[J].中国病原生物学杂志,2022,17(9):999-1004.

[14]蒋静雯,王云龙,李玉林,等.含分子内佐剂的SARS-CoV-2RBD域重组蛋白制备及免疫效果评价[J].生物工程学报,2022,38(9):3353-3362.

[15]侯玉珍,张婷,胡贵方,等.GⅡ.4诺如病毒P结构域单克隆抗体的制备与鉴定[J].细胞与分子免疫学杂志,2020,36(8):734-739.

基金资助:河南省中原学者工作站项目(224400510017);

文章来源:杜雪,赵印震,张怡青,等.基于生物信息学诺如病毒多表位抗原的构建及鉴定[J].中国免疫学杂志,2024,40(11):2391-2398.