冠心病（coronary heart disease,CHD）是一种影响冠状动脉的心血管疾病，2019年全球约有888万人死于CHD，是全世界死亡的主要原因[1]。而动脉粥样硬化是动脉中的长期炎症过程，由于动脉粥样硬化的影响而使冠状动脉中的血流减少或阻塞时，就会引发CHD[2]。研究证明动脉粥样硬化与血管内皮损伤、炎症反应、氧化应激等密切相关[3]。据报道蛋白激酶B(protein kinase B,Akt）/核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2）/血红素氧合酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1）信号通路参与炎症反应、氧化应激等引发的相关疾病[4]。如谭安安等[5]研究证明在CHD大鼠模型中，长春西汀可以缓解模型大鼠病理变化，改善血管内皮损伤，可能通过激活PI3K/Akt通路抑制氧化应激反应和炎症反应实现。蓝萼甲素（glaucocalyxin A,GLA）是一种二萜类化合物，含有对映体骨架结构，具有抗动脉硬化、免疫抑制、抗血栓、抗肿瘤、抗凝、抗氧化、抗菌等多种药理作用[6]，但其治疗CHD的效果及机制尚不明确。本研究旨在探讨GLA调节Akt/Nrf2/HO-1信号通路对CHD大鼠血管内皮损伤的影响。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

60只清洁级健康雄性Wistar大鼠由莱岸科技（广州）有限公司提供，体质量220～250 g,7周龄。饲养条件：室温（24±1）℃，相对湿度（55±5）%，明暗交替12 h，大鼠可自由饮水、进食，在实验前均适应性喂养1周。本研究经武汉华联科生物技术有限公司动物伦理委员会审核批准（动物伦理批号：KYLKS202116）。

1.1.2实验试剂与仪器

GLA购自上海源叶科技有限公司；Akt/Nrf2/HO-1通路抑制剂-LY294002购自北京启维益成科技有限公司；磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K）、p-Akt、Akt、Nrf2、HO-1一抗及羊抗兔-Ig G-HRP二抗购自Abcam公司；BCA试剂盒购自武汉博斯特生物技术有限公司；IL-6、TNF-α ELISA试剂盒、丙二醛（malondialde‑hyde,MDA）及总抗氧化能力（total antioxidant capac‑ity,T-AOC）试剂盒购自南京建成有限公司；内皮功能指标-内皮素-1(endothelin-1,ET-1）、一氧化氮（nitric oxide,NO)ELISA试剂盒、RIPA裂解缓冲液购自碧云天公司。

Multiskan MK2型酶标仪购自Lab system Ltd；离心机购自海安亭科学仪器厂；电泳仪购自北京六一仪器厂；SMT100V小动物自动生化分析仪购自南京电子医疗器械厂。

1.2方法

1.2.1 CHD大鼠模型的制备及干预

参照文献[7]制备CHD大鼠模型：将适应1周的大鼠按照随机数表法分为造模组（50只）、对照组（10只），其中造模组大鼠前16周饲喂高脂饲料（4%胆固醇、10%猪油、5%白糖、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶以及80.3%基础饲料），然后连续腹腔注射30 U/kg垂体后叶素3 d。对照组前16周饲喂基础饲料，后腹腔注射等量蒸馏水，连续3 d。16周后采集大鼠静脉血进行血脂水平检测，通过评估动脉粥样硬化指数（atherogenic index,AI）判断CHD大鼠模型是否制备成功，其中AI在3个月及以上持续大于3.8即为造模成功[8]。

将造模组大鼠随机分为CHD组、GLA低剂量（GLA-L）组、GLA中剂量（GLA-M）组、GLA高剂量（GLA-H）组、GLA-H+LY294002组。其中GLA-L组、GLA-M组、GLA-H组大鼠分别腹腔注射5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg GLA[9];GLA-H+LY294002组在GLA-H组基础上给予40 mg/kg LY294002腹腔注射干预[10];CHD组、对照组给予等体积的生理盐水干预，以上各组每天干预1次，连续干预7 d。

1.2.2自动生化分析仪检测血脂代谢水平

干预7 d后，尾静脉收集大鼠血样，3 000 r/min离心10 min，采用自动生化分析仪检测低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C）、总胆固醇（total cholesterol,TC）及三酰甘油（triacylglycerol,TG）水平。

1.2.3检测各组大鼠炎症因子及血管内皮功能指标、氧化应激指标水平

大鼠麻醉后处死，采集心脏内的血液样本，2 000 r/min离心20 min，收集上层血清，严格按照ELISA试剂盒检测炎症因子（TNF-α、IL-6）水平以及血管内皮功能指标（ET-1、NO）含量；腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠后，断头处死，取出心脏，分离心脏组织，匀浆后离心，按照试剂盒要求检测氧化应激指标（MDA、T-AOC）含量。

1.2.4 HE及油红染色检测冠状动脉病理学变化及斑块面积

麻醉并取出大鼠心脏，排出残留血液后，于右室下处作一小切口，然后暴露右室，沿主动脉根部找到右冠状动脉，固定于甲醛溶液中，经常规脱水、包埋后制备切片，然后进行脱蜡、苏木素中浸染，洗涤后经伊红染色，乙醇脱水、透明并封固，于镜下观察冠状动脉病理学变化。

分离主动脉并行纵向剖开，甲醛溶液固定，异丙醇（质量分数60%）同步化，60%的油红染色，洗涤后，对着色的动脉进行拍照，Image J软件测量斑块比例，计算斑块面积。

1.2.5 Western blot检测Akt/Nrf2/HO-1通路相关蛋白表达

取出心脏组织，加入1 000μl RIPA细胞裂解缓冲液，3 000 r/min离心5 min收集上清液，BCA试剂盒测定蛋白浓度，然后将蛋白转移至膜上，通过SDS-PAGE在100 V下分离蛋白质条带，然后5%脱脂牛奶封闭。加入以下稀释抗体：PI3K(1∶1 000）、p-Akt(1∶1 000）、Akt(1∶2 000）、Nrf2(1∶500）、HO-1(1∶500）、β-actin(1∶2 000内参）于4℃下孵育膜过夜，TBST洗涤后，加入二抗，之后添加化学发光底物以观察蛋白质印迹，Image J软件进行量化分析。

1.3统计学分析

实验数据采用SPSS27.0软件分析，以±s表示计量资料；单因素方差分析用于多组间比较，以SNK-q检验进一步两两比较，P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 GLA对各组大鼠血脂代谢水平的影响

与对照组相比，CHD组TG、TC、LDL-C含量显著增加（P<0.05）；与CHD组相比，GLA-L组、GLA-M组、GLA-H组TG、TC、LDL-C含量显著降低（P<0.05）；与GLA-H组相比，GLA-H+LY294002组TG、TC、LDL-C含量显著增加（P<0.05）。见表1。

2.2 GLA对各组大鼠炎症因子水平的影响

与对照组相比，CHD组TNF-α、IL-6含量显著增加（P<0.05）；与CHD组相比，GLA-L组、GLA-M组、GLA-H组TNF-α、IL-6含量显著降低（P<0.05）；与GLA-H组相比，GLA-H+LY294002组TNF-α、IL-6含量显著增加（P<0.05）。见表2。

表1 各组大鼠血脂代谢水平的比较（xˉ±s,n=10,mmol/L)

2.3 GLA对各组大鼠氧化应激水平的影响

与对照组相比，CHD组T-AOC含量显著降低，MDA含量显著增加（P<0.05）；与CHD组相比，GLA-L组、GLA-M组、GLA-H组T-AOC含量显著增加，MDA含量显著降低（P<0.05）；与GLA-H组相比，GLA-H+LY294002组T-AOC含量显著降低，MDA含量显著增加（P<0.05）。见表3。

2.4 GLA对各组大鼠血管内皮功能指标水平的影响

与对照组相比，CHD组NO含量显著降低，ET-1含量显著增加（P<0.05）；与CHD组相比，GLA-L组、GLA-M组、GLA-H组NO含量显著增加，ET-1含量显著降低（P<0.05）；与GLA-H组相比，GLA-H+LY294002组NO含量显著降低，ET-1含量显著增加（P<0.05）。见表4。

表2 各组大鼠炎症因子水平的比较（±s,n=10,pg/ml)

表3 各组大鼠氧化应激水平的比较（±s,n=10)

2.5 GLA对各组大鼠冠状动脉病理学及斑块面积的影响

对照组大鼠冠状动脉结构清晰，细胞排布规则有序，无病理损伤；CHD组内皮细胞损伤脱落，细胞层次不明、厚薄不匀，斑块面积显著增加（P<0.05);GLA-L组、GLA-M组、GLA-H组血管壁结构逐渐趋于正常，内皮脱落逐渐减少，排布趋于规则，斑块面积显著较CHD组降低（P<0.05);GLA-H+LY294002组局部内皮脱落，厚薄不均，排列不规则，斑块面积显著较GLA-H组增加（P<0.05）。见图1、图2、表5。

2.6 GLA对各组大鼠Akt/Nrf2/HO-1通路相关蛋白的表达水平的影响

与对照组相比，CHD组PI3K、p-Akt/Akt、Nrf2、HO-1表达显著降低（P<0.05）；与CHD组相比，GLA-L组、GLA-M组、GLA-H组PI3K、p-Akt/Akt、Nrf2、HO-1表达显著增加（P<0.05）；与GLA-H组相比，GLA-H+LY294002组PI3K、p-Akt/Akt、Nrf2、HO-1表达显著降低（P<0.05）。见图3、表6。

表4 各组大鼠内皮功能指标水平的比较（±s,n=10)

图1 大鼠冠状动脉病理学变化（HE，×200)

图2 大鼠斑块面积变化（油红染色）

表5 各组大鼠斑块面积比较（±s,n=10)

图3 心脏组织中PI3K、Akt、p-Akt、Nrf2、HO-1蛋白表达

表6 各组大鼠心脏组织中PI3K、Akt、p-Akt、Nrf2、HO-1表达的比较（±s,n=10)

3、讨论

CHD是一种威胁人类健康的血管疾病。临床上主要是由于冠状动脉狭窄、阻塞，导致组织缺氧、缺血、坏死，患者还有心绞痛、乏力、心悸等症状，不及时治疗还会引起心肌梗死、心力衰竭，严重者会影响患者的生命安全[11]。因此，寻找治疗冠心病的新方法尤为重要。本研究通过高脂饲料喂养及腹腔注射垂体后叶素制备CHD大鼠模型，通过3个月及以上AI数值持续大于3.8鉴定CHD大鼠制备成功，可进行深入研究。

GLA属于二萜化合物，从蓝萼香茶菜中提取得到，具有一些重要的生物活性，如细胞毒性和抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗凝血、抗血栓、免疫和抗神经炎症活性[12]。如朴艺花等[13]研究发现GLA降低卵清蛋白诱导的哮喘小鼠中促炎细胞因子的水平，改善哮喘小鼠不良症状。在动物皮肤被动过敏反应研究中，GLA可以抑制炎症反应，改善小鼠过敏反应[14]。除此之外，ZHU等[15]研究发现GLA抑制过氧化氢诱导的冠状动脉平滑肌细胞的氧化应激和炎症反应，发挥抗动脉粥样硬化的活性。基于以上报道，推测GLA可能参与CHD的进展。此外，研究发现炎症反应及氧化应激在CHD进展中发挥重要作用，脂质最易受到氧化应激，而TC、LDL-C是脂质的主要目标，可形成脂质氢过氧化物，最终分解形成栓[16]。本实验研究发现CHD大鼠中，血脂代谢水平（TG、TC、LDL-C）、炎症反应（TNF-α、IL-6含量）、斑块面积以及氧化应激水平显著增加，但经GLA干预后，血脂代谢水平、炎症反应以及氧化应激水平均被抑制，表明GLA可以减轻CHD大鼠中的炎症反应及氧化应激损伤。另外，CHD及动脉硬化的显著特征是血管内皮细胞受损，而血管内皮细胞受损与炎症反应密切相关，可使内皮活性物质（NO、ET-1）发生紊乱[17]。本研究发现CHD大鼠中NO显著增加，ET-1含量降低，提示CHD大鼠血管内皮明显受损。经GLA干预后，上述指标发生逆转，表明GLA可以改善CHD大鼠血管内皮受损，但其机制尚不清楚。

Nrf2是一种抗氧化转录因子，被包括PI3K/Akt在内的蛋白激酶激活，与抗氧化反应元件结合，启动多种抗氧化和抗炎蛋白以及下游基因HO-1的表达，而HO-1是治疗氧化应激相关疾病的潜在靶点，具有抗氧化、抗炎、抗增殖、抗凋亡活性[18]。如角质形成细胞生长因子-2通过激活Akt/Nrf2/HO-1通路可以保护人晶状体上皮细胞免受氧化应激损伤及细胞凋亡[19]。PENG等[20]研究发现GLA通过激活Akt/Nrf2/HO-1通路保护H9c2细胞免受缺氧/复氧诱导的损伤，可能是预防和治疗心肌梗死的有效药物。本研究发现CHD大鼠中PI3K、p-Akt/Akt、Nrf2、HO-1表达降低，提示CHD的发生可能与Akt/Nrf2/HO-1通路被抑制有关。经GLA干预后，CHD大鼠中PI3K、p-Akt/Akt、Nrf2、HO-1表达升高，不良症状及内皮受损得到缓解，推测GLA可能通过激活Akt/Nrf2/HO-1通路发挥保护内皮受损的作用。为验证上述推测，实验引入Akt/Nrf2/HO-1通路抑制剂-LY294002，结果发现LY294002逆转了GLA对CHD大鼠的保护作用。

综上所述，GLA可抑制炎症反应及氧化应激水平，改善CHD大鼠病理损伤及内皮功能障碍，可能与激活Akt/Nrf2/HO-1信号通路有关，本研究仅对心肌组织中部分指标进行探索，存在不足之处，后续将增加心肌相关指标的研究，进一步验证实验结论。

参考文献:

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[5]谭安安,陈晨.长春西汀通过PI3K/AKT通路改善冠心病大鼠模型心肌氧化应激损伤的机制研究[J].中国循证心血管医学杂志,2020,12(9):1114-1117.

[8]董素娟,万书平,杨广龙.芝麻素对冠心病大鼠脂代谢,血管内皮功能损伤及VCAM-1水平的影响[J].临床和实验医学杂志,2019,18(12):1242-1246.

[9]陈侃.蓝萼甲素对油酸所致急性呼吸窘迫综合征大鼠的治疗作用及机制研究[D].延吉:延边大学.

[10]董秀娟,曹若愚,于洪基,等.大蒜素调控PI3 K/Akt/Nrf2通路对大鼠子宫内膜异位症的影响[J].河北医学,2022,28(4):572-577.

[13]朴艺花,王知广,姜京植,等.蓝萼甲素通过HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路缓解卵清蛋白诱导的哮喘小鼠气道炎症[J].国际药学研究杂志,2020,47(9):738-744.

[14]朴艺花,宋艺兰,王知广,等.蓝萼甲素通过抑制HMGB1/TLR4/NF-KB信号通路减轻肥大细胞脱颗粒引起的过敏反应[J].药学学报,2021,56(1):201-207.

[16]岳慧娟.卡维地洛联合尼可地尔对冠心病患者血浆血红素加氧酶1,免疫功能,炎症反应及氧化应激的影响[J].哈尔滨医药,2022,42(2):1-4.

[17]张晓蕾,许国莹,王士珍,等.miR-186-5p对冠心病大鼠血管内皮细胞损伤及FGF2/FGFR1信号通路的影响[J].天津医药,2021,49(11):1169-1174.

基金资助:湖北省中医药中西医结合科研项目(ZY2019M043);

文章来源:杜睿凯,朱浩.蓝萼甲素调节Akt/Nrf2/HO-1信号通路对冠心病大鼠的影响[J].中国免疫学杂志,2024,40(11):2267-2272.