近年来，癌症免疫治疗已经成为一种极具吸引力的治疗方法，在血液恶性肿瘤和黑色素瘤等晚期恶性肿瘤治疗方面取得了巨大的成功[1]。但癌症免疫治疗总体有效率低于30%，而免疫相关不良反应率高达30%～60%，且易产生耐药性，一旦治疗失败可能会延误肿瘤治疗，因此需要提高治疗的疗效，实现更加安全、持久的免疫治疗[2-3]。大量研究表明，泛素化及去泛素化通过促进肿瘤微环境中免疫杀伤细胞的募集和增殖、抑制髓系来源的免疫抑制细胞、调节免疫检查点及细胞外基质和内皮间质转化，从而增强机体的抗肿瘤效果[4-5]。因此本文主要围绕泛素化及去泛素化对免疫微环境及免疫检查点的影响进行阐述。

1、肿瘤免疫治疗

正常人的免疫系统具有免疫监视、防御、调控功能，当体内肿瘤细胞形成时，免疫系统能识别并清除“非己”细胞，抵御肿瘤细胞生长。然而，肿瘤细胞通过下调肿瘤抗原表达、上调免疫检查点、促使T细胞衰竭和表型变化、募集髓系来源的免疫抑制细胞和释放免疫抑制因子等免疫逃避机制来逃避免疫系统的识别和攻击，从而加速肿瘤细胞的增殖、侵袭和远处转移[6]。因此，针对肿瘤细胞免疫逃逸研发的靶向程序性死亡受体1/配体1(PD-1/PD-L1）、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4）的免疫检查点抑制剂，通过恢复和激活T细胞对肿瘤细胞产生免疫应答，使淋巴瘤患者治疗有效率高达80%，以及50%的晚期黑色素瘤患者肿瘤消退、病情得到长期持久的控制[3,7]。因此，肿瘤免疫治疗备受国内外学者的关注。

2、泛素化及去泛素化修饰

泛素化是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式，在癌症、感染、免疫及神经退行性疾病等病理性过程中发挥重要的调控作用。泛素化是指76个氨基酸残基组成的泛素蛋白，通过E1泛素活化酶、E2泛素结合酶、E3泛素连接酶结合到底物蛋白赖氨基酸残基上的过程[8]。泛素化最终将E3连接酶结合的底物转移至蛋白酶体降解。去泛素化酶的作用与泛素化酶相反，主要通过去除泛素化链逆转泛素化，从而导致泛素化终止并保留底物蛋白。泛素化及去泛素化不仅对癌细胞的增殖和凋亡有重要影响，而且通过促使巨噬细胞向M2型极化、树突状细胞（dendritic cells,DCs）的成熟，提高NK细胞和T细胞的活化和肿瘤浸润以及降低免疫检查点的表达，进而形成抗肿瘤免疫微环境，抑制肿瘤免疫逃逸并增强化疗、免疫治疗的效果，是近年研究的一个重要成果和药物开发的新靶点[9]。

3、泛素化与去泛素化修饰对固有免疫细胞的调控

3.1泛素化对巨噬细胞的调控

肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage,TAM）是肿瘤间质的重要成分，受不同细胞因子的影响极化为具有抗肿瘤作用的M1型巨噬细胞和促肿瘤作用的M2型巨噬细胞[10]。靶向泛素连接酶Cop1、UBR5、去泛素化酶USP10，通过影响底物蛋白或信号通路，降低CCL2、CSF-1等因子的分泌和TAM的募集，并促进M1型以及抑制M2型巨噬细胞分化，从而抑制肿瘤细胞的增殖和转移[11-13]。最新研究显示，靶向去泛素化酶USP7和泛素结合酶FATS分别通过激活P38MAPK和NF-κB信号通路，促进肿瘤微环境中M2型巨噬细胞重编程为M1型巨噬细胞，并增强Th1和细胞毒性T淋巴细胞等适应性免疫反应以促进肿瘤消退[14-15]。因此，靶向泛素化酶及去泛素化酶不仅可以减少浸润于肿瘤微环境中TAM的数量，而且通过促进TAM向抗肿瘤的亚型极化而增强免疫治疗的疗效。

3.2泛素化对NK细胞的调控

NK细胞是固有免疫的关键元素，既可以直接杀死癌症或被感染的细胞，也可间接改善抗体和T细胞介导的反应[16]。细胞因子IL-15一方面介导去泛素化酶Otub1的膜募集，抑制AKT激活进而控制CD8+T细胞和NK细胞的激活[17]；另一方面，IL-15诱导AKT磷酸化导致XBP1s蛋白质去泛素化增加了其稳定性和核积累，从而使NK细胞中颗粒酶B(granzyme B,GZMB）和IFN-γ表达上升，增强了NK细胞的细胞毒性[18]。同样地，沙利度胺等免疫调节药发挥作用时也通过泛素连接酶CRBN触发GZMB的表达，增强了NK细胞抗多发性骨髓瘤的作用[19]。泛素连接酶CBLB是NK细胞功能的负调节因子，通过脂质纳米包裹siRNAs递送到靶点沉默CBLB，能有效增强NK细胞的增殖和细胞毒性而杀伤肿瘤细胞[20-21]。因此，寻找改变NK细胞激活和抑制信号平衡的泛素化及去泛素化酶，是增强NK细胞的活性和细胞毒性而直接杀伤肿瘤细胞的重要方法。

3.3泛素化对DCs的调控

DCs是启动和调节先天性和适应性免疫的核心，但肿瘤微环境中MHC分子呈递肿瘤相关抗原功能缺陷、缺乏共刺激信号以及抑制性受体高表达，限制了T细胞的活化，促进了肿瘤免疫逃逸[22]。大量研究表明，泛素化参与MHCⅠ限制抗原加工和交叉呈递外源性蛋白质，在DC抗原加工呈递中具有至关重要的作用[23-24]。MHCⅠ、MHCⅡ作为影响抗原呈递的主要多肽，表达水平直接决定免疫应答的强度，去泛素化酶UCH-L1能正向调节MHCⅠ再循环和抗原向CD8 T细胞的交叉呈递，而泛素连接酶March-1缺陷促进DC中MHCⅡ的表面表达，两者都增强了DC的抗原呈递和T淋巴细胞的激活[25-26]。相关研究表明，A20和OTUB1是泛素化调控相关的酶，沉默A20和增加OTUB1表达激活DC中NF-κB的信号传导，诱导促炎细胞因子IL-6、TNF-α和IL-12表达升高，有助于T淋巴细胞激活和数量增加，增强了抗肿瘤免疫[27-28]；另一方面，A20沉默增强了DC共刺激分子的表达，抑制Treg细胞并促进肿瘤浸润性T细胞活化，延缓了肿瘤生长[27,29]。可见，DC是启动和维持适应性免疫应答的中心环节，而泛素化及去泛素化通过调控DC抗原加工和呈递、共刺激信号以及促炎因子的表达，介导肿瘤浸润性T细胞的激活。

4、泛素化与去泛素化修饰对T、B淋巴细胞的调控

4.1泛素化对T细胞的调控

肿瘤微环境中T细胞激活受损、衰竭增加、溶细胞活性减弱，是引起肿瘤免疫逃逸的重要原因[30]。T细胞受体（T cell re‑ceptor,TCR）为T细胞激活提供主要信号，敲除泛素连接酶Grail的CD8+T细胞，通过持续的TCR-CD3信号传导和IL-21受体高表达，增强CD8+T细胞的激活和细胞毒性[31]。而Nrdp1则是通过TCR信号通路中激酶Zap70的K33连接泛素化及酸性磷酸酶样蛋白对其的磷酸化，终止CD8+T细胞早期TCR信号传导[32]。此外，还有研究发现，靶向去泛素化酶USP15能激活JAK-STAT-TET2信号通路和诱导泛素连接酶MDM2降解，进而刺激淋巴细胞的活化、浸润[33-34]；而靶向泛素连接酶Cbl-b通过诱导PD1、Tim3表达减少及增加IFN-γ和TNF-α表达，不仅抑制了CD8+T细胞的衰竭，而且提高了肿瘤杀伤力[35]；尤其是TCR激活后能介导泛素连接酶Mule活化，诱导转录因子KLF4发生K48泛素化降解后，引起p21、p27表达减少，促进肿瘤浸润性T淋巴细胞的增殖[36]。CD4+T细胞在直接杀伤肿瘤细胞和辅助CD8+T激活、杀伤中发挥十分关键的作用，而USP12通过去泛素化稳定B细胞淋巴瘤10(BCL10）并激活NF-κB信号通路，引起CD4+T细胞活化和增殖[37]；不同的是，靶向泛素连接酶Peli1导致TCR刺激的代谢酶m TORC1的激活和HIF-1α、c-myc的高表达，促进糖酵解，增加了CD4 T细胞的肿瘤浸润[38]。FOXP3对调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）的发育及免疫稳定有至关重要的作用，在黑色素瘤模型小鼠中，敲除去泛素化酶USP44和泛素连接酶Si‑ah2，通过降低FOXP3表达，抑制了Treg功能和肿瘤浸润，导致肿瘤生长迟缓和抗肿瘤免疫增强[39-40]。另外，泛素化还能调节由细胞因子引起的信号转导，IL-15介去泛素化酶Otub1的膜募集，Otub1负调控AKT激酶激活，使CD8+T细胞对抗原刺激不敏感而影响细胞的激活[17]。泛素化酶通过增强CD8+T细胞、CD4+T细胞及抑制Treg的激活过程、活性、数目，显著增强了抗肿瘤免疫治疗的效果。

4.2泛素化对B细胞的调控

肿瘤浸润性B细胞和浆细胞在抗肿瘤免疫中可发挥积极作用，并且B细胞能将同源肿瘤衍生抗原呈递于T细胞协作以促进抗肿瘤免疫[41]。有研究发现，泛素化相关酶（如cCbl和FBXO10）不仅在调控B细胞的发育、分化、增殖中起重要作用[42-43]，而且通过靶向泛素化相关酶（如USP7、FBXW7），能抑制B细胞恶性肿瘤的生长以及克服肿瘤治疗的耐药性[44-45]。但泛素化是否影响肿瘤浸润性B细胞以及与肿瘤免疫逃逸的确切关系和机制仍不清楚，有待进一步研究，对是否应该设计免疫疗法增强或抑制这些细胞具有决定意义。

5、泛素化对免疫检查点的影响

5.1泛素化对PD-1或PD-L1通路的调控

PD-1/PD-L1是抗癌免疫治疗的主要靶点之一，但总体反应率普遍较差，有研究证明泛素化翻译后修饰对PD-1/PD-L1引起的免疫抑制有重大影响[46]。Casitas B谱系淋巴瘤（Casitas B lymphoma,c-Cbl）是RING型泛素连接酶的成员，在结直肠癌模型小鼠中，cCbl的缺乏上调肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞和巨噬细胞中PD-1蛋白的表达[47]，而Casitas B细胞淋巴瘤-b(Cbl-b）缺乏不仅可以诱导PD-1、Tim3表达减少，还可抑制内源性CD8+T和外源性CAR T的细胞耗竭以及增加IFN-γ和TNF-α的表达，提高肿瘤杀伤力[35]。此外，c-cbl和cbl-b通过抑制PI3K/Akt、Jak/Stat和MAPK-Erk信号通路，下调PD-L1表达[48]。在黑色素瘤和结直肠模型小鼠中，FBXO38促进了PD-1的内化和随后的泛素化以及蛋白酶体降解，从而下调肿瘤微环境中T细胞中的PD-1水平，抑制肿瘤生长[49]。相关研究表明，抑制去泛素化酶CSN5、USP22或激活泛素连接酶ARIH1，通过促进PD-L1的泛素化和蛋白酶体降解使PD-L1表达降低，抑制肿瘤生长并促进细胞毒性T细胞活化[50-52]。与以上PD-1/PD-L1经蛋白酶体调节不同的是，CMTM6不仅能特异性调节质膜和再循环内体中的PD-L1，而且通过阻止PD-L1被STUB1泛素化降解来延长PD-L1的半衰期[53-54]。而在结肠癌小鼠模型中，抑制剂pal‑bociclib抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6），但促进泛素连接酶cullin 3-SPOP的降解而增加PD-L1蛋白表达，因此palbociclib与抗PD-1联合治疗可显著提高小鼠总体存活率[55]。此外，在Treg细胞中泛素连接酶Stub1能导致Foxp3降解，而Foxp3是PD-L1的负调节剂，因此抑制Stub1能显著增加PD-L1表达[56];DCUN1D1不仅能激活肺癌细胞中FAK致癌信号通路，而且上调了PD-L1表达，但其调节PD-L1的分子机制仍待进一步研究[57]。综上所述，泛素化及去泛素化通过对蛋白酶体降解、不同区室或细胞周期阶段以及上游调控因子的调控，影响PD-1/PD-L1表达，以提高癌症患者的免疫治疗效果，见图1（自绘）。

图1 泛素化及去泛素化对免疫细胞的影响

5.2泛素化对CTLA4或B7通路的调控

CTLA-4与B7结合会拮抗B7-CD28激活信号，从而抑制T细胞活化并维持免疫系统的稳态[58]。克氏锥虫感染期间泛素连接酶GRAIL的上调导致CD4+T细胞中CTLA-4和PD-1的表达显著增加，使CD4+T细胞无反应性[59]。此外，在T细胞恶性肿瘤中蛋白酶体功能障碍导致GATA3表达增加，以及CTLA-4的转录上调和稳定性增加，进而抑制T细胞反应[60]。研究表明，泛素连接酶MARCH参与了B7-2和MHCⅠ、MHCⅡ细胞表面蛋白的泛素化及降解，导致免疫逃逸[61-62]。因此，进一步研究CTLA-4和B7的蛋白丰度与泛素化及去泛素化的相关性，可为免疫检查点治疗提供新的思路。

6、泛素化与去泛素化对肿瘤微环境的影响

肿瘤微环境是指肿瘤细胞存在的周围微环境，由免疫细胞、成纤维细胞、细胞外基质、细胞因子、生长因子以及周围血管等组成，在肿瘤发生、发展中发挥关键作用[63]。上皮间质转化（epithelial-mes‑enchymal transition,EMT）使肿瘤发生过程中原本没有侵袭、迁移能力的细胞获得浸润转移的能力，会诱导产生肿瘤干细胞和治疗方案耐药性。肿瘤细胞中泛素连接酶HRD1和MDM2上调肿瘤细胞中MMP2和MMP9的表达和分泌，导致细胞外基质降解，增加了肿瘤的转移[64-65]；而泛素连接酶RNF43、NRBE3通过泛素化降解E-钙黏蛋白，增加肿瘤细胞的活动[66-67]；同样的，TGF-β和IL-6分别诱导去泛素化酶USP27X和Dub3表达，稳定转录因子Snail1促进EMT，增强了肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移[68-69]。肿瘤快速增殖和血管异常导致肿瘤内缺氧，缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）的表达是细胞应对缺氧的机制之一，而一些泛素连接酶（TRAF6）和去泛素化酶（USP7、USP19）通过增加HIF-1α表达，进而诱导肿瘤发生过程中的血管形成、细胞迁移和EMT[70-71]。泛素化酶和去泛素化酶是肿瘤微环境中细胞和非细胞成分的调节剂，为癌症治疗提供了潜在的治疗靶点。

7、泛素化与去泛素化酶抑制剂对免疫治疗的影响

泛素-蛋白酶体通路异常和恶性肿瘤之间存在相关性，因此靶向该通路是治疗癌症的理想方法之一。其中，蛋白酶体抑制剂研发、应用最快，硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米已经上市并用于多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤及实体瘤的治疗[72]。但蛋白酶体抑制剂特异性差，易造成不良反应（如周围神经病变、血液毒性、免疫力下降）和产生耐药性，使蛋白酶体抑制剂的临床应用受到限制[73]。

与蛋白酶体抑制剂相比，靶向底物特异性较高的泛素连接酶或去泛素化酶，能增强调控特异性及肿瘤治疗效果。天然产物也是靶向治疗的重要来源，如：白藜芦醇处理泛素连接酶β-Trcp降低三阴性乳腺癌细胞中PD-L1蛋白的表达[74]。在结肠癌小鼠模型中，CDK4/6抑制剂palbociclib和抗PD-1联合治疗能增强抗肿瘤治疗效果，提高小鼠总体生存率[55]。来那度胺是第二代免疫调节药物，通过靶向膜相关环状蛋白Ⅰ（membrane-associated RING-CHⅠ，MARCH-Ⅰ）能促进DC呈现半成熟型，增强吞噬能力，已用于多发性骨髓瘤治疗[75]。而另一种免疫调节药CC-122目前正处于临床Ⅰ期试验阶段，其通过调节cereblon泛素连接酶而具有抗肿瘤和免疫调节活性[76]。在促炎因子诱导抗肿瘤免疫逃逸的研究中，姜黄素抑制了去泛素化酶CSN5的活性并减少了慢性炎症介导的基于PD-L1的肿瘤免疫抑制，而且增敏了三阴性乳腺癌、黑色素瘤和结肠癌小鼠模型中的抗CTLA-4的治疗效果[50]。

蛋白水解靶向嵌合体（proteolysis-targeting chi‑meras,PROTACs）是一种异双功能分子，可同时连接目标蛋白和泛素连接酶进行降解。PROTACs不仅将药物研发模式从“占用驱动”型变为“事件驱动”型，而且能降解不可成药的蛋白[77]。蛋白水解靶向嵌合体通过靶向雄激素受体和雌激素受体在前列腺癌和乳腺癌治疗中有一定疗效[78-79]，并且已进入临床Ⅱ期试验，见表1。最新研究显示，将光诱导调控加入PROTACs中，让药物在肿瘤内发挥药效，降低了毒副反应，提高了药物治疗的时空精确度[80]。

表1 泛素化/去泛素化酶抑制剂在肿瘤免疫治疗中的应用

8、展望

泛素化是一种翻译后修饰的调控机制，与肿瘤微环境、肿瘤的发生发展密切相关，是肿瘤治疗领域的新热点。大量研究报道，靶向泛素化酶和去泛素化酶能通过减少Treg、TAM的数量和向M2型极化、促进DCs的成熟、增加NK和T细胞数量、活性以及抑制免疫检查点表达，来抑制肿瘤免疫逃逸并增强治疗效果。因此，泛素化及去泛素相关药物不仅疗效明显、抗肿瘤谱广，而且能靶向不敏感、不可成药的靶点，一旦与传统的化疗、靶向治疗、免疫治疗等联合使用，能显著提高抗肿瘤作用，为癌症治疗药物开发提供了大量机会。但是，泛素化和去泛素化相关药物存在脱靶、细胞渗透性差、特异性差等缺陷，并且大多还处于动物模型或体外研究中，与其他药物的联合治疗还在临床试验中，因此需要进一步研究相关药物的开发和临床应用，为癌症治疗提供更多的选择。

参考文献:

[22]许斌,谌亮,宋启斌,等.树突状细胞在肿瘤免疫和免疫治疗中的研究进展[J].现代肿瘤医学,2021,29(14):2543-2547.

基金资助:国家自然科学基金(32170729);甘肃省自然科学基金青年项目(21JR7RA418);

文章来源:张雪,石文贵,焦作义.泛素化与去泛素化修饰在肿瘤免疫调控中的研究进展[J].中国免疫学杂志,2024,40(11):2427-2433.