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药用植物厚朴活性物质和厚朴酚对运动性心肌损伤和细胞凋亡的保护作用

2023-07-19 68 上传者：管理员

摘要：厚朴(Magnolia officinalis)是一种传统中药，属木兰科木兰属植物，和厚朴酚是从中药厚朴中提取的一种天然酚类活性物质，具有多种药理特性。以前研究结果显示和厚朴酚具有多种心脏保护作用。本研究旨在探讨和厚朴酚对强烈运动小鼠心肌损伤的影响。研究结果表明：与对照组相比，模型组的LVEF [(81.24±5.33)%比(50.31±6.52)%]、SOD [(68.51±8.90) U/mg比(26.71±2.11) U/mg]、GSH-Px [(43.64±3.75) U/mg比(13.42±0.98) U/mg]显著降低，下调Bcl-2 (0.79±0.07比0.23±0.02)蛋白表达；LVESd [(1.37±0.15) mm比(2.94±0.11) mm]、LVIDd [(4.33±0.46) mm比(6.92±0.62) mm]、ROS [(112.31±12.74)μmol/L比(268.74±26.81)μmol/L]、细胞凋亡率[(6.85±0.47)%比(31.24±3.72)%]显著增加，增加TNF-α [(89.78±7.52) pg/mL比(356.95±32.11) pg/mL]、IL-6 [(41.24±3.52) pg/mL比(168.42±15.36) pg/mL]、IL-1β [(56.71±5.47) pg/mL比(195.41±23.42) pg/mL]释放，上调Bax (0.31±0.05比0.94±0.06)、Cleaved caspase-3 (0.18±0.03比0.18±0.03)蛋白表达。与模型组比较，低、中、高剂量组LVEF、SOD、GSH-Px显著增加，上调Bcl-2蛋白表达；LVESd、LVIDd、ROS、细胞凋亡率显著降低，减少TNF-α、IL-6、IL-1β，下调Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达(P<0.05)。和厚朴酚可减轻强烈运动小鼠心肌组织氧化应激、炎症反应，抑制心肌细胞凋亡。

关键词：
中药
厚朴
和厚朴酚
心肌损伤
细胞凋亡
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厚朴(Magnolia officinalis)是木兰科木兰属植物。厚朴为著名中药，树皮、花、种子及芽皆可入药，具有健胃消食、行气平喘、明目益气、驱风镇痛等功效。和厚朴酚是从中药厚朴中提取的一种天然酚类活性物质，具有多种药理特性，如抗肿瘤、抗氧化、抗炎及保护心肌损伤等(Yuan et al.,2020)。有研究结果显示，和厚朴酚具有多种心脏保护作用。例如，和厚朴酚参与调节糖尿病小鼠心脏线粒体底物利用和细胞脂肪酸代谢(Jayakumari et al.,2021)。和厚朴酚通过激活线粒体Sirt3抑制小鼠心肌肥大(Pillai et al.,2015)。和厚朴酚通过抑制氧化应激和炎症减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤(Wang et al.,2013)。厚朴酚通过抑制线粒体凋亡减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤(Lüet al.,2022)。

心脏主要功能是为血液流动提供动力，且对运输氧气、代谢物、营养物质具有积极作用。研究发现，有规律的运动可利于心脏健康，但强烈运动或过度训练会破坏心脏的形态结构，从而引起心肌损伤(Rao et al.,2018)。由于运动训练对心肌功能影响各不相同，强度训练可引起运动员心肌损伤，对运动员正常训练、运动能力等有影响，严重时会造成运动性猝死(Ramez et al.,2020)。可见，研究运动性心肌损伤对其具有积极保护作用。尽管运动性心肌损伤发病机制尚不明确，但有研究显示，运动性心肌损伤与氧化应激、炎症反应和细胞凋亡等有关(Li et al.,2020;Tuo et al.,2021)。

由于和厚朴酚具有优异的心脏保护作用，本研究推测其可能在防治运动性心肌损伤方面具有应用前景，可对其进行研究，且目前关于和厚朴酚在防治运动性心肌损伤方面的研究较少。因此，本研究通过构建强烈运动小鼠心肌损伤模型，并探究和厚朴酚对强烈运动小鼠心肌组织氧化应激、炎症反应及心肌细胞凋亡的影响。

1、结果与分析

1.1各组小鼠心功能比较

模型组的LVEF较对照组低，LVESd、LVIDd较对照组高(P<0.05)；与模型组比较，低、中、高剂量组LVEF较模型组高，LVESd、LVIDd较模型组低(P<0.05)(表1)。

1.2各组小鼠心肌组织氧化应激比较

模型组小鼠心肌组织SOD、GSH-Px较对照组低，ROS较对照组高(P<0.05)；低、中、高剂量组小鼠心肌组织SOD、GSH-Px较模型组高，ROS较模型组低(P<0.05)(表2)。

1.3各组小鼠心肌组织炎症反应比较

模型组小鼠心肌组织TNF-α、IL-6、IL-1β较对照组高(P<0.05)；低、中、高剂量组小鼠心肌组织TNF-α、IL-6、IL-1β较模型组低(P<0.05)(表3)。

表1各组小鼠心功能比较

1.4各组小鼠心肌细胞凋亡率比较

模型组小鼠心肌组织细胞凋亡率较对照组高(P<0.05)；低、中、高剂量组小鼠心肌组织细胞凋亡率较模型组低(P<0.05)(表4)。

表2各组小鼠心肌组织SOD,GSH-Px,ROS比较

表3各组小鼠心肌组织炎症反应比较

1.5各组小鼠心肌组织凋亡相关蛋白表达比较

模型组小鼠心肌组织Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达较对照组高，Bcl-2蛋白表达较对照组高、低，(P<0.05)；低、中、高剂量组小鼠心肌组织Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达较模型组低，Bcl-2蛋白表达较模型组高(P<0.05)(图1;表5)。

2、讨论

和厚朴酚具有抗菌、抗病毒、抗氧化等作用，对心血管、中枢神经系统具有良好的药理活性，如和厚朴酚可减轻三氧化二砷诱导的小鼠心脏毒性，减轻小鼠心肌细胞凋亡，并改善小鼠心功能和心脏重塑(Huang et al.,2022)。研究显示，和厚朴酚对重度烧伤大鼠心肌损伤有保护作用，可能与改善心功能、抗炎、抗氧化等有关(纪兆乐等,2021)。和厚朴酚可减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤，从而提高心肌组织抗凋亡、抗炎能力，发挥保护心脏的作用(马静等,2022)。有研究发现，和厚朴酚可减轻糖尿病大鼠心肌组织损伤，可改善大鼠心功能，并提高心肌组织抗炎、抗氧化能力(孙加凤等,2020)。本研究发现，分别给予小鼠灌胃不同剂量和厚朴酚后，小鼠呈剂量依赖性改善心功能，并增加SOD、GSH-Px活性，减少心肌组织ROS、TNF-α、IL-10、IL-1β释放，细胞凋亡率也明显减少，Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达下调，而Bcl-2蛋白表达上调，可见，和厚朴酚可减轻强烈运动小鼠心肌损伤，这与孙加凤等(2020)研究结果相似，表明和厚朴酚对运动性心肌损伤具有保护作用。

图1 Western blot检测Bcl-2,Bax,Cleaved caspase-3蛋白表达

表4各组小鼠心肌细胞凋亡率比较

表5各组小鼠心肌组织Bcl-2,Bax,Cleaved caspase-3蛋白比较

越来越多的研究表明，长期强烈运动可以引起心肌细胞发生氧化应激和炎症损伤，继而造成心肌细胞异常凋亡，引起心肌出现不同程度运动性损伤(Parry-Williams et al.,2021;Yan et al.,2021)。氧化应激与心肌损伤密不可分，心肌受损后可促进心肌细胞产生过多ROS，导致抗氧化物酶系统平衡也被打破，使SOD、GSH-Px失活，从而造成心脏能量合成受阻，影响心脏功能(Cui et al.,2020)。当心肌氧化损伤激活后，可促进心肌细胞释放更多TNF-α、IL-6、IL-1β因子，诱导机体发生炎症反应，进一步进展心肌损伤程度(Bai et al.,2019)。心肌细胞凋亡可加重心肌损伤，Bcl-2和Bax是凋亡相关蛋白，相互拮抗可促进细胞发生线粒体凋亡，从而诱导级联反应，促进caspase家族活化，激活凋亡信号传导途径，进而诱导细胞活化(Luan et al.,2019)。本研究通过构建小鼠模型，结果显示，模型组小鼠心功能发生改变，心肌组织SOD、GSH-Px活性降低，ROS、TNF-α、IL-10、IL-1β及细胞凋亡异常增加，Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达上调，而Bcl-2蛋白表达下调，提示强烈运动小鼠心肌损伤模型构建成功。

综上所述，本研究发现和厚朴酚可减轻强烈运动小鼠心肌损伤，其可能与改善小鼠心功能、抑制心肌细胞凋亡、提高心肌组织抗炎及抗氧化有关。

3、材料与方法

3.1实验材料

和厚朴酚(纯度≥98%)购于北京普非生物科技有限公司；C57BL/6雄性小鼠50只，购于北京维通利华实验动物公司，许可证号：SCXK(京)2018-0011。小鼠饲养于本实验，室内温度23℃～26℃，昼夜交替各12 h，自由饮食和饮水，待小鼠适应1周后开始实验。

3.2实验动物分组及模型构建

将50只小鼠分为对照组(Control)、模型组(Model)、低剂量组(Low dose group)、中剂量组(Medium dose group)、高剂量组(High dose group)，每组10只。其中低、中、高剂量组分别给予灌胃5.0、10.0、20.0 mg/kg和厚朴酚，对照组、运动模型组灌胃等量生理盐水。1次/d，连续灌胃6周。

参照刘胤(2019)构建强烈运动小鼠心肌损伤模型，除对照组外，其余40只小鼠进行5 d适应性训练，每天训练15 min。适应性训练结束，开始进行正式运动训练，40 min/次，每组训练6 d，休息1 d，连续训练6周。力竭模型评估标准：对小鼠进行光、电、声及机械刺激后，小鼠不能翻正，并伏地喘息。

3.3心功能检测

实验结束24 h后，采用多普勒超声检测各组小鼠的左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF%)、左心室舒张期内径(left ventricular diastolic diameter,LVIDd)和左心室收缩末径(left ventricular end systolic diameter,LVESd)。

3.4氧化应激指标检测

心功能检测结束后，脱颈处死小鼠，取小鼠心肌组织，制备心肌组织匀浆液。3 000 r/min离心10 min，具体操作参照ELISA试剂盒说明书进行，检测SOD、GSH-Px、ROS。

3.5炎症反应指标检测

ELISA法检测各组小鼠心肌组织TNF-α、IL-6、IL-1β。

3.6 TUNEL法检测细胞凋亡

取小鼠心肌组织，用4%多聚甲醛固定，包埋、并制成5μm石蜡切片，参照试剂盒TUNEL溶液，滴加DAB显色液，显色10 min，脱水处理，晾干后用中性树胶封片。在200倍显微镜下观察，经图像分析仪分析细胞凋亡。

3.7蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达

将RIPA裂解液加入至小鼠心肌组织，获得的总蛋白按照BCA法检测定量后，取50μg上样蛋白，经过SDS-PAGE分离蛋白，结束后迅速转移至PVDF膜上，加脱脂奶粉封闭培养1.5 h，加Bcl-2(稀释1:1 000)、Bax (稀释1:1 000)、Cleaved caspase-3(稀释1:800)、GAPDH (稀释1:2 000)一抗4℃过夜孵育，次日加山羊抗兔二抗(稀释1:5 000)室温孵育1.5 h，最后加电化学发光试剂，定量、拍照。以GAPDH作为内参，用分析软件Image Lab分析蛋白条带的密度值。

3.8数据统计分析

使用SPSS 19.0分析处理数据，用(±s)表示计量资料，组间比较采用LSD-t检验，多组间比较使用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

作者贡献

巴旭是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成数据分析；巴旭和罗乐完成论文初稿的写作与修改。两位作者都阅读并同意最终的文本。

基金资助：河南省教师教育课程改革研究项目(2021-JSJYYB-099)资助；

文章来源:巴旭,罗乐.药用植物厚朴活性物质和厚朴酚对运动性心肌损伤和细胞凋亡的保护作用[J].分子植物育种,2023,21(13):