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黄连素促人牙髓干细胞成骨成牙本质细胞向分化的影响

2020-08-01 258 上传者：管理员

摘要：目的：研究黄连素对人牙髓干细胞（hDPSCs）增殖及成骨/成牙本质细胞向分化的影响，为促进年轻恒牙牙根继续发育提供新思路。方法：分离培养hDPSCs，流式细胞术鉴定细胞表型，诱导染色评估多向分化潜能。用不同浓度黄连素（0、1、3、10、30μmol/L）刺激hDPSCs，通过CCK-8法、碱性磷酸酶活性检测、q-PCR法检测各组细胞增殖和成骨/成牙本质细胞向分化能力。结果：改良组织块酶消化法成功分离hDPSCs并对其鉴定。CCK-8结果显示培养7d内，0～10μmol/L浓度的黄连素对hDPSCs增殖无影响，30μmol/L组在第7天时抑制细胞增殖。黄连素浓度为1、3μmol/L时细胞碱性磷酸酶活性显著升高。q-PCR结果也显示黄连素能上调成骨和成牙本质相关基因mRNA表达，且促进效果在浓度为1和3μmol/L时最显著。结论：黄连素在1～3μmol/L浓度范围内能促进hDPSCs成骨/成牙本质细胞向分化。

关键词：
人牙髓干细胞
成牙本质分化
成骨分化
药学
黄连素
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年轻恒牙牙根发育不完全，根尖孔未闭，牙本质壁较薄弱，临床上常见因龋病、外伤、牙体发育异常等造成牙髓感染坏死、根尖发育停止。传统治疗多采用根尖诱导成形术，但治疗后的患牙根管壁薄，易折断，远期预后不佳。再生性牙髓治疗是一种生物学治疗方法，其目的是替换受损牙髓组织，形成牙髓-牙本质复合体，支持牙根的继续发育[1]。

随着组织工程技术的发展，牙源性干细胞促进牙髓-牙本质复合体再生受到关注。人牙髓干细胞是一种存在于牙髓组织的成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能[2]。2000年Gronthos等[3]首次从人第三磨牙分离培养了hDPSCs，与羟基磷灰石/磷酸三钙复合在裸鼠皮下形成牙髓-牙本质复合体，证明了其分化为成牙本质细胞的潜能。黄连素（Berberine）是一种异喹啉类生物碱，被广泛用于治疗消化系统疾病，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、降血糖等多重药理作用[4]。有研究显示黄连素可抑制破骨作用[5]，也可直接促进干细胞成骨分化[6]。本实验旨在探究不同浓度的黄连素对hDPSCs增殖和成骨/成牙本质细胞向分化的影响，为促进年轻恒牙牙根继续发育提供实验基础。

1、材料与方法

1.1主要材料与设备

DMEM培养基（Gibco，美国）；胎牛血清（Gibco，美国）；0.25%胰酶（Gibco，美国）；PBS溶液（凯基，中国）；成脂诱导培养基（Cyagen，美国）；CCK-8试剂盒（同仁，日本）；碱性磷酸酶检测试剂盒（碧云天，中国）；BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒（碧云天，中国）；TRIzol(Invitrogen，德国）；PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit(TaKaRa，日本）；SYBRGreenSupermix(Bio-rad，美国）。Steril-GARD超净工作台（Baker，美国）；细胞培养箱（Thermo，美国）；流式细胞仪（Becton-Dickinson，美国）；酶联免疫检测仪；VeritiPCR热循环仪；Step One Real-Time PCR Systemmachine。

1.2方法

1.2.1hDPSCs的培养

改良组织块酶消化法分离培养hDPSCs[7]。收集来自南京市口腔医院颌面外科拔除的完整、无龋的第三磨牙，志愿者年龄为18～25岁。在超净工作台内，用含10%双抗的PBS溶液冲洗离体牙3～4次，劈开牙体，取出新鲜牙髓，剪碎成约（1×1)mm2的小块。收集组织块，加入浓度为3g/L的Ⅰ型胶原酶，在37℃条件下消化30～60min。待牙髓消化成絮状，终止消化。在1000r/min,4℃条件下离心5min，弃上清。将组织块均匀平铺在25cm2的培养瓶底部，倒置培养瓶后加入5mL含20%胎牛血清的高糖DMEM，将培养瓶置于27℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中。4h后小心翻转培养瓶，使培养基均匀浸没贴壁的组织块。待原代牙髓细胞扩增后，将细胞转移至10cm的培养皿中。每3d更换1次培养基，第3～5代细胞用于进一步实验。

1.2.2hDPSCs表型鉴定

采用流式细胞术鉴定hDPSCs表型。选取第2代的hDPSCs，消化成细胞悬液。在流式管中加入5×105个细胞/管，PBS溶液洗1次，在1000r/min,4℃条件下离心5min，弃上清。加入100μLPBS溶液重悬细胞，按抗体说明书加入对应体积的抗体：FITCanti-humanCD31、CD34、CD45、CD90、CD146,AlexaFluor488anti-humanCD29、CD105MonoclonalAntibody,STRO-1MonoclonalAntibody混匀。4℃避光孵育30min。PBS洗2次，重悬，流式细胞仪上机检测。

1.2.3hDPSCs分化潜能鉴定

将第3代hDPSCs以104个细胞/孔的密度接种在24孔板中。细胞生长至80%融合时，加入诱导培养基。（1）成骨分化潜能：每孔加入500μL成骨诱导培养基（DMEM+10%FBS、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50g/L抗坏血酸、0.1μmol/L地塞米松）每3d换液，7d后进行碱性磷酸酶染色，21d后进行茜素红染色，观察矿化情况。（2）成脂分化潜能：每孔加入500μL成脂诱导培养基，每3d换液，14d后进行油红O染色，观察脂滴形成情况。

1.2.4黄连素对hDPSCs增殖的影响

利用CCK-8法评估黄连素对hDPSCs增殖的影响。将第3代hDPSCs以3000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。待细胞贴壁24h，换用含不同浓度（0、1、3、10、30μmol/L）黄连素的完全培养基培养，每3d换液。在加入黄连素后的1、3、5、7d每孔加入10μLCCK-8溶液，37℃孵育2h，用酶标仪在450nm波长下测定A值。每组实验设置5个复孔。

1.2.5黄连素对hDPSCs分化的影响

1.2.5.1碱性磷酸酶活性检测

将第3代hDPSCs以105个细胞/孔的密度接种在6孔板中。细胞贴壁24h，加入不同浓度黄连素刺激，细胞生长至80%融合时，加入诱导培养基。（1）成骨诱导培养基（同前）；（2）成牙本质诱导培养基（DMEM+10%FBS、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50g/L抗坏血酸）。在诱导的第3、7天进行检测。使用蛋白裂解液裂解细胞，离心收集上清，按碱性磷酸酶检测试剂盒说明书操作，样品加入量为30μL，与显色底物在37℃孵育10min，在405nm波长下测定A值。在24孔板中进行碱性磷酸酶染色。将细胞用不含磷酸钙的PBS漂洗2次，4%多聚甲醛室温固定15min，然后根据BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒进行染色，拍照。

1.2.5.2q-PCR

将第3代hDPSCs以105细胞/孔的密度接种在6孔板中，黄连素刺激7d后使用TRIzol收集总RNA，将等量RNA逆转录为cDNA。使用SYBR?GreenSupermix在StepOneTM实时PCR系统以cDNA为模板上进行实时定量PCR，检测成骨分化相关基因ALP、Runx2、OCN、OSX、OPN、VEGF、Ang-1和成牙本质相关基因DSPP在hDPSCs中的表达，以肌动蛋白（β-actin）作为内参。利用2-△△Ct方法分析测定基因表达水平。所用引物序列见表1。

表1q-PCR引物及其序列

1.2.6统计学分析

使用GraphPadPrism5软件进行两组间t检验，多组间完全随机设计的单因素方差分析检验，P<0.05时认为差异有统计学意义。

2、结果

2.1hDPSCs的分离培养和鉴定

改良组织块酶消化法成功分离培养hDPSCs，细胞呈短梭形，胞质均匀，细胞核大，见图1a。采用流式细胞检测显示其间充质干细胞特征标记物CD90(92.1%）、CD105(93.7%）、CD146(98.2%）、STRO-1(95.9%）表达大于90%，造血系细胞标记物CD31(0.85%）、CD34(1.08%）、CD45(0.61%）表达小于1.0%。hDPSCs成骨诱导7d碱性磷酸酶染色可见矿化结节，21d茜素红染色阳性，成脂诱导处理14d后，油红O染色能观察到脂滴形成，见图1b、1c、1d。本实验证明分离培养获得的hDPSCs具有多向分化潜能。

图1hDPSCs的原代分离培养及鉴定

2.2黄连素对hDPSCs增殖的影响

随着培养时间的增长，在黄连素1～30μmol/L浓度范围内hDPSCs增殖均呈上升趋势。在前5d时间内，1～30μmol/L浓度的黄连素对hDPSCs增殖无影响，30μmol/L组在第7天时较空白组增殖较差（P<0.05），见图2。可能原因是随着药物浓度的升高，对细胞增殖产生了抑制作用。

图2黄连素对hDPSCs增殖的影响

2.3黄连素对hDPSCs分化的影响

2.3.1碱性磷酸酶活性结果

成骨/成牙本质诱导培养3d和7d后，黄连素对hDPSCs碱性磷酸酶活性的影响如图3和表2。成骨诱导结果显示与空白对照相比，黄连素在浓度为1和3μmol/L时可显著上调细胞内碱性磷酸酶表达，但随着浓度的升高，呈抑制作用。成牙本质诱导结果显示实验浓度范围内的黄连素均能促进碱性磷酸酶的表达，但其作用不呈浓度依赖性，在浓度为1和3μmol/L时具有显著性意义（P<0.05）。碱性磷酸酶染色结果与活性测定结果一致。

表2hDPSCs碱性磷酸酶活性

图3黄连素对hDPSCs碱性磷酸酶染色的影响

2.3.2q-PCR结果

hDPSCs在不同浓度黄连素刺激下培养7d后，检测细胞内成骨和成牙本质相关基因mRNA表达，见表3、表4，发现黄连素浓度在1和3μmol/L时成骨分化早期分化相关基因ALP、成骨转录因子OSX、Runx2，成骨分化后期相关基因OCN表达上调。所有浓度组OPN表达均增强（P<0.05）。同时1和3μmol/L黄连素处理组血管生成因子VEGF和Ang-1的表达也显著升高。高浓度药物组对成骨及血管相关基因的表达有抑制作用。成牙本质分化特异性基因DSPP在所有浓度组均较空白对照表达上调（P<0.05）。因此我们认为黄连素在1～3μmol/L浓度时具有促进hDPSCs成骨/成牙本质分化的作用。

表3hDPSCs成骨/成牙本质分化相关基因mRNA的表达水平

表4hDPSCs成骨/成牙本质分化相关基因mRNA的表达水平

3、讨论

hDPSCs是一种外胚层来源的，具有多谱系分化潜能的间充质干细胞[8]，能够分化成软骨细胞、脂肪细胞、成牙本质细胞和神经样细胞[9]。牙髓干细胞来源广泛，易取材，通过比较DPSC和MSC的抗原特性，发现二者只有少数基因的表达不同[10]。Ponnaiyan等[11]比较了DPSC和MSC的克隆形成潜力，发现DPSC的增殖速率明显高于MSC，成骨诱导分化后，DPSC可产生更多的矿化结节具有更高的成骨分化潜能。同时DPSC作为牙源性间充质干细胞，其成牙本质潜能优于MSC，控制着牙髓牙本质复合体的再生。本实验提取的hDPSCs经流式鉴定表达MSCs表面标记物，造血系细胞标记物阳性表达小于1.0%，阳性表达CD90、CD105、CD146，胚胎干细胞的表面标记物STRO-1大于95%，且能在不同诱导条件下向成骨细胞、脂肪细胞分化，证明了其具有干细胞多向分化能力的特征，在再生牙髓治疗中具有重要潜力。

对干细胞分化的诱导是再生牙髓治疗的关键，传统诱导因子主要为生长因子[12]，但生长因子价格昂贵和易失活的特点限制了其使用。黄连素作为一种传统中药提取物，用药较为安全，具有抗菌、抗炎、降糖、降脂等多重药理作用。近年来有学者发现黄连素具有骨保护作用。Lee等[13]发现黄连素可通过p38MAPK/Runx2依赖通路直接促进MSCs成骨分化。本课题组前期研究也证实，黄连素可以恢复牙龈卟啉单胞菌导致的MSCs中成骨相关基因表达的下调[14]。DPSCs向成牙本质细胞分化过程中涉及的生化途径与MSCs向成骨细胞分化过程中涉及的生化途径相似[15]。本研究结果显示黄连素能上调成骨和成牙本质相关基因mRNA的表达，在成骨细胞的分化和成熟中起着促进作用。血管生成在成骨分化中起着重要作用[16]，黄连素能上调VEGF,Ang-1的表达进一步证明黄连素对成骨分化有积极作用。DSPP作为成牙本质分化特异性基因，在各黄连素浓度刺激下均高表达。本研究结果与Wu等[17]一致，他们发现黄连素是通过经典的Wnt/β-catenin途径加速了DPSC的矿化并增加了成牙本质细胞分化标记蛋白的表达。

因此，本研究证明了hDPSCs是用于牙髓再生研究的理想细胞，同时浓度为1～3μmol/L的黄连素可以促进hDPSCs成骨/成牙本质细胞向分化，可为年轻恒牙牙根继续发育提供新思路。

参考文献：

[2]牛玉梅,何丽娜.牙髓干细胞在牙髓牙本质再生中的研究进展[J].口腔医学研究,2018,34(9):923-927.

[4]邓晓威,谢宁.黄连素及其衍生物的药效学研究进展[J].中医药学报,2017,45(4):108-111.

[7]刘影,高杰,吴补领.改良组织块酶消化法原代培养人牙髓干细胞的研究[J].口腔疾病防治,2018,26(3):166-170.

[9]叶青松,王晓燕.牙源性干细胞储存和临床应用的研究进展[J].口腔疾病防治,2018,26(1):15-25.

马兰,禹怡君,刘含笑,刘超,苗雷英.黄连素促人牙髓干细胞成骨/成牙本质细胞向分化[J].口腔医学研究,2020,36(07):639-643.

基金:国家自然科学基金面上项目(编号:81570952);科教强卫工程江苏省青年医学人才(编号:QNRC201612);南京市医学科技发展项目(编号:ykk18126).