癫痫是一种常见的神经系统疾病，其发作是脑神经元群体激活所导致的网络事件，涉及海马神经元丢失和神经网络功能障碍。排斥导向分子-a(repulsive guidance molecule-a, RGMa)在神经系统发育和修复中扮演着重要角色[1]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3β(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B/glycogen synthase kinase 3β,PI3K/Akt/GSK-3β)信号通路是细胞增殖、存活和凋亡等多种生物学过程的关键调控通路之一，其激活是缺血后机体的保护机制之一，在神经系统疾病的发生和发展中也起着重要作用[2]。艾司氯胺酮是一种有潜力的抑郁症治疗药物[3]。本研究旨在探究艾司氯胺酮介导微小核糖核酸-142-5p(microRNA-142-5p,miR-142-5p)靶向调控RGMa对癫痫大鼠海马神经元损伤的影响机制。

一、材料与方法

1 材料

动物SPF级SD雄性大鼠，鼠龄6周，体质量180～220 g, 西安交通大学实验动物中心提供。动物许可证号：SCXK(陕)2020-001。本实验经西安交通大学伦理委员会批准(伦理批号：XJTUAE2023-1901)。

细胞人胚肾细胞(HEK293),购自上海思泰默生物科技有限公司。

药品与试剂盐酸艾司氯胺酮注射液，规格：每支2 mL/50 mg(按C13H16ClNO计),批号：20220113,批准文号：国药准字H20193336,江苏恒瑞医药股份有限公司生产；氯化锂，规格：每瓶10 g, 纯度：99%,批号：2H73J1-2025-07-30,上海麦克林生化科技股份有限公司生产；毛果芸香碱，规格：每瓶10 mg, 纯度：99.80%,批号：283870,美国MCE公司生产；miR-142-5p激活药，美国MCE公司生产。诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide sythase, iNOS)抗体、精氨酸酶1(arginase 1,Arg1)抗体、PI3K抗体、磷酸化PI3K(phosphorylated PI3K,p-PI3K)抗体、Akt抗体、磷酸化Akt(phosphorylated Akt, p-Akt)抗体、GSK-3β抗体、磷酸甘油醛脱氢酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体、山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)二抗、山羊抗兔IgG二抗、山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)二抗，均为英国Abcam公司生产；磷酸化GSK-3β(phosphorylated GSK-3β,p-GSK-3β)抗体、Trizol试剂、cDNA逆转录试剂盒，均为美国Thermo Fisher Scientific公司生产；Trizol总RNA抽提试剂、苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining, HE)染色试剂盒、脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒，均为上海碧云天生物技术股份有限公司生产。引物，均由美国Thermo Fisher Scientific公司合成。

仪器CFX96 Touch聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)仪，美国Bio-Rad公司产品；DM2500荧光显微镜，德国徕卡公司产品。

2 实验方法

2.1 模型构建、动物分组与给药方法

将50只大鼠随机分为5组，每组各10只。对照组：腹腔注射0.9% NaCl; 模型组：腹腔注射3 mmol·L-1·kg-1氯化锂溶液，16 h后腹腔注射50 mg·kg-1毛果芸香碱溶液，根据Racine量表评分标准判断造模是否成功，模型组均达Ⅳ～Ⅴ级发作[4];艾司氯胺酮组：在模型组的基础上，腹腔注射50 mg·kg-1盐酸艾司氯胺酮注射液；miR-142-5p mimic组：在艾司氯胺酮组的基础上，左侧侧脑室海马区注射miR-142-5pmimic慢病毒液2 μL和0.9% NaCl 2 μL;RGMa组：在艾司氯胺酮组的基础上，左侧侧脑室海马区注射miR-142-5p mimic2 μL和RGMa慢病毒液2 μL。

2.2 HE染色法检测大鼠海马神经元结构[5]

组织样本固定在固定液中，脱水和包埋后制备成石蜡切片。将海马组织石蜡切片用苏木精染液进行染色，逐级乙醇脱水，用伊红染液进行对比染色，二甲苯透明，切片放置于玻璃载玻片上，随后用中性树胶封存，在光镜下观察大鼠海马神经元结构。

2.3 TUNEL染色法检测大鼠海马神经元细胞的凋亡率[5]

将制备好的海马组织石蜡切片经过常规二甲苯溶液脱蜡、梯度乙醇水化后，用蛋白酶K溶液消化处理，切片浸入TUNEL反应混合液，37 ℃避光孵育1 h, 洗涤3次。加入4′,6-联脒-2′-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)溶液染色，室温避光孵育10 min, 洗涤3次，用防荧光猝灭封片剂封片，随后在荧光显微镜下观察。

2.4 免疫荧光染色法检测iNOS和Arg1的表达情况[6]

用4%多聚甲醛固定细胞30 min, 0.5% Triton X-100作用2 min使细胞膜通透，1% 牛血清白蛋白封闭2 h, 加入iNOS抗体(1∶500)、Arg1抗体(1∶500),在4 ℃孵育过夜，次日室温避光孵育Alexa Fluor®488山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)、Alexa Fluor®647山羊抗兔IgG二抗(1∶1 500),并用DAPI染核，最后用荧光显微镜观察获取图像。

2.5 实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)法检测miR-142-5p与RGMa mRNA的表达水平[7]

用Trizol法提取总RNA,逆转录成cDNA,用试剂盒检测各样品中相关基因及内参的相对表达水平，具体操作步骤按说明书进行。以2-ΔΔCt法表示目的mRNA的相对表达水平。

2.6 双荧光素酶报告基因实验验证miR-142-5p与RGMa的靶向关系[7]

将野生型或突变型RGMa的3′UTR扩增并克隆到pmirGLO载体中，接着将前述质粒分别和miR-142-5p共转染HEK293细胞，最后用双荧光素酶报告物测定系统来测量荧光素酶活性。

2.7 蛋白质印迹法检测RGMa蛋白及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β的表达水平[8]

将海马组织用裂解液裂解，定量蛋白质浓度后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE),然后用聚偏二氟乙烯膜湿转转膜。5%脱脂奶粉室温封闭，加入iNOS一抗(1∶1 000)、Arg1一抗(1∶1 000)、p-PI3K一抗(1∶1 000)、PI3K一抗(1∶1 000)、p-Akt一抗(1∶500)、Akt一抗(1∶500)、GSK-3β一抗(1∶500)、p-GSK-3β一抗(1∶500)、GAPDH一抗(1∶500),4 ℃孵育过夜。磷酸盐吐温缓冲液(phosphate buffer solution-Tween, PBST)清洗3次，每次5 min。随后按1∶1.0×104稀释HRP山羊抗兔IgG二抗，再次孵育30 min, 用PBST清洗3次，每次5 min, 然后用全自动化学发光分析仪检测。

3 统计学处理

用SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料用

表示，2组间比较用两样本均数t检验，多组间比较用单因素方差分析。

二、结果

1 艾司氯胺酮对癫痫大鼠海马组织神经元凋亡的影响

对照组腹腔注射0.9% NaCl; 模型组腹腔注射3 mmol·kg-1氯化锂溶液，16 h后腹腔注射50 mg·kg-1毛果芸香碱溶液；艾司氯胺酮组在模型组的基础上，腹腔注射50 mg·kg-1盐酸艾司氯胺酮注射液；miR-142-5p mimic组在艾司氯胺酮组的基础上，左侧侧脑室海马区注射miR-142-5p mimic慢病毒液2 μL和0.9% NaCl 2 μL;RGMa组在艾司氯胺酮组的基础上，左侧侧脑室海马区注射miR-142-5pmimic 2 μL和RGMa慢病毒液2 μL。

HE染色结果显示：对照组大鼠的海马神经元排列有序且致密，细胞结构清晰完整，大小正常，核染色均匀；模型组大鼠海马的神经元损伤明显，部分神经元丢失，细胞间间隙增大且排列紊乱；艾司氯胺酮组神经元损伤减轻，大部分细胞排列较规则，形态正常。结果见图1。

TUNEL染色结果显示：模型组的神经元细胞凋亡率较对照组显著升高[(58.33±8.34)%vs(7.14±0.93)%,P<0.05],而艾司氯胺酮组的神经元细胞凋亡率较模型组显著降低[(36.47±5.49)%vs(58.33±8.34)%,P<0.05]。

2 艾司氯胺酮对癫痫大鼠海马组织中小胶质细胞中iNOS和Arg1蛋白表达的影响

对照组、模型组和艾司氯胺酮组的iNOS[1型巨噬细胞(type 1 macrophage, M1)极化标志物]相对荧光强度分别为10.03±3.11、64.03±8.15和32.67±5.89,Arg1(M2极化标志物)相对荧光强度分别为21.46±4.17、8.26±1.23和14.28±3.55。模型组相较于对照组，iNOS相对荧光强度显著升高，Arg1相对荧光强度显著降低(均P<0.05);艾司氯胺酮组相较于模型组，iNOS相对荧光强度显著降低，而Arg1相对荧光强度显著升高(均P<0.05)。结果见图2。

3 艾司氯胺酮对癫痫大鼠海马组织中miR-142-5p和RGMa mRNA的表达水平的影响

对照组、模型组和艾司氯胺酮组的miR-142-5p相对表达水平分别为1.00±0.09、3.21±0.52和1.92±0.32,RGMamRNA相对表达水平分别为1.00±0.12、0.54±0.09和0.81±0.11。模型组相较于对照组，miR-142-5p相对表达水平显著升高，而RGMamRNA相对表达水平显著降低(均P<0.05);艾司氯胺酮组相较于模型组，miR-142-5p相对表达水平显著降低，RGMamRNA相对表达水平显著升高(均P<0.05)。模型组中RGMa蛋白相对表达水平(0.47±0.09)显著低于对照组(1.00±0.11),艾司氯胺酮组的RGMa蛋白相对表达水平(0.79±0.12)显著高于模型组(均P<0.05)。结果见图3。

图1艾司氯胺酮对癫痫大鼠海马组织病理形态学的影响(苏木精-伊红染色，×200)

4 miR-142-5p和RGMa的靶向关系验证

通过Targetscan预测发现，miR-142-5p和RGMa存在结合位点，见图4。双荧光素酶报告基因实验结果显示，相较于转染NC mimic(WT-RGMa: 1.00±0.06,MUT-RGMa: 1.00±0.08),miR-142-5p mimic与RGMa(野生型)共转染的荧光素酶活性(0.71±0.05)显著降低(P<0.05),而miR-142-5p mimic与RGMa(突变型)共转染的荧光素酶活性(0.99±0.07)相较于转染NC mimic无显著性差异(P>0.05)。

图2用免疫荧光染色法检测各组大鼠中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶1(Arg1)的阳性表达(×200)

图3用蛋白质印迹法检测各组癫痫大鼠海马组织中排斥导向分子-a(RGMa)蛋白的表达水平

5 艾司氯胺酮通过miR-142-5p/RGMa对PI3K/Akt/GSK-3β信号通路的影响

艾司氯胺酮组与模型组相比，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β比值均显著升高(均P<0.001);miR-142-5p mimic组与模型组比较，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β比值均显著升高(均P<0.001);而RGMa组与miR-142-5p mimic组比较，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β比值均显著升高(均P<0.001),见表1。

图4miR-142-5p与RGMa的结合位点预测

表1各组大鼠脑组织中磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3β(PI3K/Akt/GSK-3β)通路相关蛋白相对表达水平的比较

三、讨论

癫痫是一种常见的神经系统疾病，其确切发病机制尚不完全清楚。癫痫的发病机制是一个复杂的过程，涉及神经元兴奋性和抑制性失衡、离子通道异常、突触传递异常、神经损伤和炎症反应以及遗传因素等多个因素的相互作用[9]。神经损伤是癫痫发生和发展的重要诱因之一。癫痫的现有治疗方法主要包括药物治疗、手术治疗、生酮饮食治疗和神经调控治疗。药物治疗是大多数癫痫患者首选的治疗方法，目的是控制发作或最大限度地减少发作次数和减轻发作时的抽搐程度，常用的药物有苯妥英钠、卡马西平等，虽然能够在一定程度上控制癫痫发作，但仍会有部分患者产生耐药，易发展为药物难治性癫痫[10-11]。氯胺酮是一种苯环己哌啶类非天然氨基酸衍生物，具有镇痛、麻醉和镇静作用。氯胺酮作为一种中枢神经系统兴奋药，在临床麻醉和手术中广泛使用。氯胺酮通过抑制γ-氨基丁酸受体，增加神经元的活动，从而增强神经元的兴奋性[12]。陈克云等[13]研究发现，氯胺酮可以通过影响谷氨酸受体的代谢能力在治疗癫痫中发挥重要的作用。

miR-142-5p是一种微小RNA分子，参与了基因表达的调控。研究表明，miR-142-5p在神经元发育和功能中发挥着重要的作用，其异常表达可能与癫痫的发生和发展有关[14],癫痫发作的急性期伴随着miR-142-5p的上调[15]。本研究结果发现，经氯胺酮处理后，miR-142-5p的表达水平出现显著降低，提示氯胺酮可能通过下调miR-142-5p的表达来抑制神经元的损伤，从而治疗癫痫症。RGMa是一种抑制中枢神经系统轴突生长的膜结合蛋白。研究发现，在毛果芸香碱诱导的癫痫模型中，RGMa在海马组织中的过表达具有抗癫痫作用，减少自发性癫痫发作[1,16-18]。上述结果表明，RGMa过表达可以成为治疗癫痫的一种替代策略。本研究结果提示，RGMa是miR-142-5p的靶基因，miR-142-5p可能通过调节RGMa的表达来影响神经元的功能，miR-142-5p和RGMa之间的相互作用在癫痫发病中具有重要意义。PI3K/Akt/GSK-3β信号通路是一条重要的细胞信号传导通路，参与了细胞生存、增殖和凋亡等过程。研究表明，在癫痫患者中，该通路的活性显著失活[19-20],这就提示激活该通路可以减轻癫痫的发作频率和严重程度。本研究中发现，经氯胺酮处理后，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β比值均较模型组显著升高。

本研究提示，氯胺酮通过miR-142-5p靶向RGMa, 调节PI3K/Akt/GSK-3β信号通路治疗癫痫大鼠的海马神经元损伤。但是由于氯胺酮存在滥用的可能，因此在临床使用中需要谨慎和仔细地评估。

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文章来源:赵茜娟,孟丽华,杨亚男,等.艾司氯胺酮对癫痫大鼠海马神经元损伤的影响[J].中国临床药理学杂志,2024,40(21):3124-3129.