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山柰酚减轻心肌缺血再灌注损伤诱导心肌细胞铁死亡作用机制

2024-08-12 123 上传者：管理员

摘要：目的:探讨山柰酚对心肌缺血再灌注(I/R)损伤中心肌细胞铁死亡的作用机制。方法:建立体内SD大鼠心肌I/R模型和体外H9c2细胞缺氧/复氧(H/R)模型，给予山柰酚干预。通过苏木精-伊红(HE)染色观察心肌形态学变化，测定血浆心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)以评估心脏损伤程度，四甲基偶氮唑盐(MTT)法评估细胞活力，蛋白免疫印迹法(Western Blot)和实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测铁死亡相关蛋白和基因变化。结果:体外实验证明山柰酚改善H/R诱导的细胞损伤，部分逆转了铁死亡相关蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、相关基因核糖体蛋白L8(RPL8)、铁反应元件结合蛋白2(IREB2)和三磷酸腺苷合酶F0复合亚基C3(ATP5G3)的变化。体内实验表明山柰酚减轻I/R诱导心肌组织病理变化，降低血清中cTnI、CK和LDH水平，抑制铁死亡相关蛋白和基因的变化。结论:山柰酚可能通过抑制心肌I/R损伤诱导的心肌细胞铁死亡发挥心脏保护作用。

关键词：
实验研究
山柰酚
心肌细胞
心肌缺血再灌注损伤
铁死亡
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冠状动脉疾病严重影响着全球人类的健康，已成为全球发病率和死亡率最高的疾病之一[1]。溶栓治疗和经皮冠状动脉介入治疗尽管是冠状动脉疾病病人最广泛使用的治疗和干预措施，但是会不可避免地诱发心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤[1-2]。再灌注时，恢复氧气供应增加了活性氧的产生，这可能促进线粒体通透性转换孔的打开并最终导致细胞损伤或者死亡[1,3-4]。虽然药物治疗可以帮助恢复缺血心肌的血液供应，但针对I/R损伤的药物开发尚未成功。因此，I/R损伤分子机制的探究和新治疗药物靶点的确定一直是研究的焦点。山柰酚(kaempferol, Kae)是一种黄酮类化合物，广泛存在于许多水果、蔬菜和药用植物中[5]。据报道，山柰酚在体内外均具有抗氧化作用、抗炎作用和免疫调节特性，目前已用于多种疾病的治疗和预防，如缺血缺氧性脑病、类风湿系统疾病、阿尔茨海默病和癌症等[5-6]。近年来的研究表明，山柰酚对心肌I/R损伤也具有一定的保护作用，如山柰酚可以通过抑制氧化应激和抗炎作用缩小I/R诱导的心肌梗死面积[7]。然而，在心肌I/R损伤中山柰酚发挥保护作用的机制目前尚不清楚。

铁死亡是一种依赖于铁离子和活性氧积累的非凋亡性细胞死亡方式，属于一种独特的调节性细胞死亡方式。铁死亡是由于谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase4,GPX4)耗竭，导致脂质过氧化物积累形成的[4,8]。目前研究已经确定了几个导致铁死亡的基因，包括核糖体蛋白L8(ribosomal protein L8,RPL8)、铁反应元件结合蛋白2(iron response element binding protein2,IREB2)和三磷酸腺苷(ATP)合酶F0复合亚基C3(ATP synthase F0complex subunit C3,ATP5G3)等[4,9-10]。最近的多项研究表明，铁死亡是心肌细胞死亡的一种重要形式，心肌I/R损伤时铁死亡在诱导心肌细胞死亡和心肌病中起到重要作用，而且抑制铁死亡可以明显减轻I/R诱导的心肌细胞损伤[11-13]。但山柰酚是否可以抑制心肌I/R损伤诱导的心肌细胞铁死亡，尚未见报道。因此，本研究探讨山柰酚对SD大鼠心肌I/R损伤的影响，并分析山柰酚对心肌I/R损伤中心肌细胞铁死亡的作用。

1、材料与方法

1.1实验动物

7～8周龄的健康雄性SD大鼠，体质量220～250g,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。

1.2心肌I/R模型建立

动物实验前12h禁食，腹腔注射戊巴比妥钠(45mg/kg)麻醉。麻醉后于胸骨左缘第4肋间微小切开胸廓暴露心脏，丝线活扣结扎左冠状动脉前降支，迅速将心脏回置胸腔、关胸。缺血45min后体外松扎，再灌注24h。

1.3分组及给药方法

将大鼠随机分为对照组(Con组)、山柰酚组(Kae组)、I/R组、I/R+Kae组。Con组：暴露左冠状动脉前降支但不结扎，腹腔注射生理盐水；Kae组：大鼠尾静脉注射山柰酚10mg/kg,其余处理同Con组；I/R组：大鼠左前降支结扎45min,再灌注24h; I/R+Kae组：大鼠缺血前30min尾静脉注射山柰酚10mg/kg,随后大鼠左前降支结扎45min,再灌注24h。

1.4细胞培养和缺氧/复氧(H/R)模型

将H9c2细胞接种在60mm培养皿中，在含有10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和100μg/mL青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养。当细胞同步化处理之后，H9c2细胞生长至80%～90%的密度时，将细胞进行缺氧/复氧(H/R)处理。将细胞的培养基换成无FBS的低糖培养基中，并将细胞在低氧三气培养箱(37℃,5%CO2和1%O2)中缺氧培养12h,随后将培养基更换为不含FBS的DMEM,在普通培养箱(37℃,5%CO2和95%空气)中进行复氧培养12h[14]。将一直在普通培养箱中培养但不更换培养基且培养时间相同的细胞作为Con组。而H/R+Kae组细胞用不同浓度的山柰酚(selleck, USA)预处理2h,然后进行H/R处理。

1.5四甲基偶氮唑盐(MTT)法

通过MTT法评估体外细胞活力。将H9c2细胞接种在96孔板中，经过H/R或GL处理后，将细胞在含有3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑的MTT溶液(0.5mg/mL)的培养基中培养4h。弃掉上清，加入二甲基亚砜(DMSO),吸出含有细胞的DMSO悬液并在490nm处量化吸光度值(optical density, OD)。通过计算公式量化细胞活力：细胞活力=治疗组OD/对照组OD。

1.6苏木精-伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色

左心室心肌组织在4%多聚甲醛中固定24h,随后用石蜡包埋。包埋的心脏组织切片(5μm),将切片固定、冲洗并用HE染色，然后用光学显微镜对其进行成像拍照。

1.7心肌损伤标志物检测

再灌注后收集血样，在4℃以5 000×g离心20min分离出血清，根据大鼠心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(SEKR-0048,Solarbio)的说明书检测cTnI水平；根据大鼠肌酸激酶(creatine kinase, CK)活性试剂盒(BC1145,Solarbio)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性检测试剂盒(BC0680,Solarbio)的说明书检测CK和LDH水平。

1.8蛋白免疫印迹法(Western Blot)

从心肌组织和H9c2细胞中提取蛋白质，通过二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定蛋白质浓度。将蛋白质(10～20μg)通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离并利用电转膜槽转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。裁膜并将膜放到兔抗GPX4(1∶1 000,Abcam, USA)和抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH,1∶3 000,Abcam, USA)一起孵育。随后将孵过一抗的膜与山羊抗兔二抗一起孵育2h,使用增强化学发光试剂(enhanced chemiluminescence, ECL)显像并保存图片。最后使用Image J测量软件对图片进行灰度值半定量分析。

1.9实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)

使用TRIzol试剂盒(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, USA)提取心肌梗死周围组织的总RNA。使用逆转录系统(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, USA)逆转录RNA(2μg)合成cDNA。随后根据SYBR q-PCR试剂盒(TaKaRa, Japan)说明书和RT-PCR仪的特点，加入引物的同时加入SYBR荧光染料，测出对应引物的表达量。具体的引物序列见表1。

表1RT-PCR引物序列

1.10统计学处理

通过GraphPad Prism8软件分析数据。符合正态分布的定量资料以均数±标准差(

表示，两组比较采用Student′st检验，多组间比较采用Bonferroni校正的单向方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1山柰酚对H/R诱导的H9c2细胞损伤的影响

首先，在体外观察山柰酚对H9c2细胞的影响。MTT结果显示，在正常培养条件下，加入山柰酚处理H9c2细胞24h后，在山柰酚浓度为100μmol/L以内时，对心肌细胞活力并不产生影响，但当山柰酚的浓度达到200μmol/L时，细胞存活率呈剂量依赖性下降(见图1)。其次，观察山柰酚对H/R诱导的H9c2细胞活力的影响。与Con组相比，H/R组心肌细胞活力明显下降，而给予山柰酚预处理后，山柰酚以剂量依赖性促进H/R后心肌细胞活力的恢复(见图2)。最后，选择山柰酚10μmol/L做了进一步观察，通过细胞计数和对培养基中LDH的检测发现，Con组和Kae组细胞计数和培养基中LDH水平比较，差异无统计学意义(P>0.05);与Con组相比，H/R组细胞计数减少并且释放到培养基中的LDH增加(P<0.05),而H/R+Kae组提升了细胞计数水平并降低了培养基中LDH含量(P<0.05)。详见图3、图4。表明山柰酚在一定浓度(100μmol/L)内，并不会对心肌细胞活力产生影响，并且可以减轻H/R诱导的H9c2细胞损伤。

图1MTT法测定不同浓度山柰酚对H9c2细胞活力的影响

图2MTT法测定不同浓度山柰酚对H/R诱导的H9c2细胞活力的影响

图3各组细胞计数比较

图4各组培养基中LDH水平比较

2.2山柰酚对H/R诱导的H9c2细胞铁死亡的影响

为了验证山柰酚是否通过抑制铁死亡来减轻H/R诱导的H9c2细胞损伤，检测铁死亡关键蛋白GPX4和铁死亡相关基因的表达。结果显示，与Con组相比，H/R组GPX4表达降低(P<0.05),而H/R+Kae组GPX4表达较H/R组升高(P<0.05),详见图5。RT-PCR结果显示，与Con组相比，H/R组铁死亡相关基因RPL8、IREB2和ATP5G3表达升高(P<0.01),而H/R+Kae组铁死亡相关基因RPL8、IREB2和ATP5G3表达较H/R组降低(P<0.05),详见图6。表明山柰酚预处理可以减轻H/R诱导的H9c2细胞铁死亡相关蛋白和基因的变化。

图5Western Blot检测各组GPX4表达

(A为各组GPX4蛋白表达条带图；B为各组GPX4表达柱状图。与Con组比较，*P<0.05;与H/R组比较，#P<0.05)

图6RT-PCR检测各组铁死亡相关基因表达

2.3山柰酚对I/R诱导的SD大鼠心肌细胞损伤的影响

通过HE染色观察山柰酚对I/R诱导的心肌形态学的影响。HE染色显示，Con组和Kae组心肌结构正常，排列规则，心肌横纹清晰。与Con组相比，I/R组心肌肌纤维断裂，细胞外间隙增大，表明I/R组心肌组织病理变化非常明显。与I/R组相比，I/R+Kae组大鼠的心脏切片显示横纹肌纤维相对更完整，破坏较少。详见图7。同时测定血浆cTnI、CK和LDH水平以评估心脏损伤程度。与Con组相比，I/R组血清中cTnI、CK和LDH水平均明显升高(P<0.01),而I/R+Kae组血清cTnI、CK和LDH水平较I/R组降低(P<0.05)。详见图8。表明山柰酚对I/R引起的心肌损伤具有保护作用。

图7HE染色观察各组心肌形态学变化

图8各组血清cTnI、CK和LDH水平比较

(A为各组cTnI柱状图；B为各组CK柱状图；C为各组LDH柱状图。与Con组比较，*P<0.01;与H/R组比较，#P<0.05)

2.4山柰酚对I/R诱导的SD大鼠心肌细胞铁死亡的影响

通过体内实验评估铁死亡相关蛋白和基因的变化。与体外细胞实验结果相似，与Con组相比，I/R组铁死亡关键蛋白GPX4表达降低(P<0.05),铁死亡相关基因RPL8、IREB2和ATP5G3表达升高(P<0.01),而与I/R组比较，I/R+Kae组GPX4表达升高(P<0.05),铁死亡相关基因RPL8、IREB2和ATP5G3表达降低(P<0.05)。表明山柰酚可抑制I/R诱导的SD大鼠心肌细胞铁死亡的发生。详见图9、图10。

图9各组GPX4表达比较

图10各组RPL8、IREB2和ATP5G3表达比较

3、讨论

再灌注疗法在治疗缺血心肌的同时，本身会诱发心肌梗死，导致心肌损伤或心肌细胞死亡[2,14]。心肌I/R损伤可表现为心律失常、心肌细胞凋亡、血流动力学紊乱、心肌酶损伤等[15]。本研究发现，在心肌I/R损伤时发生铁死亡，并伴有心肌酶的改变，而用山柰酚干预心肌I/R损伤后，心肌细胞铁死亡减少，并伴有心肌酶损伤水平降低，表明山柰酚可能通过抑制心肌细胞铁死亡减轻心肌I/R损伤。

山柰酚是一种广泛分布的黄酮醇类化合物，已被证明具有抗氧化、抗炎等多种生物活性，并且具有保护心脏等作用[16]。在顺铂诱导的C57BL/6小鼠心脏毒性模型中，山柰酚可通过调节干扰素基因刺激因子(STING)/核因子-κB(NF-κB)通路来降低顺铂诱导的细胞凋亡和炎症反应，减轻心脏毒性反应[17]。Guo等[18]的研究发现，山柰酚通过沉默调节蛋白1(SIRT1)介导的线粒体途径来减少活性氧生成，保存线粒体膜电位，减少细胞色素C从线粒体向细胞质的释放，从而保护心肌细胞免受缺氧/再氧合损伤；此外，山柰酚也可通过调控Bcl-2和Bax蛋白及对抑制Caspase-3的激活，调节心肌I/R损伤诱导的细胞死亡，减轻心脏损伤[19]。本研究中的体外实验显示，山柰酚明显减轻了H/R诱导的心肌细胞损伤，并降低了培养基中LDH含量；同样，体内实验表明，山柰酚可明显抑制SD大鼠I/R损伤时的心肌结构损伤并降低血清中cTnI、CK和LDH水平。上述结果表明山柰酚对I/R引起的心肌损伤具有保护作用。

铁死亡是一种相对较新的可调控的细胞死亡形式[20]。导致铁死亡的关键因素是二价铁的积累，谷胱甘肽依赖性抗氧化防御机制的破坏，导致GPX4的耗竭和脂质过氧化物的积累[4,12]。多项研究表明，铁死亡是心肌细胞死亡的一种重要形式，I/R损伤导致心肌细胞铁死亡[11]。本研究从体内心肌I/R损伤和体外H/R损伤模型中发现，模型组心肌细胞中GPX4活性降低，铁死亡相关基因表达增加，提示I/R和H/R模型组中心肌细胞发生铁死亡，而给予山柰酚治疗后，促进了GPX4的表达，抑制了铁死亡相关基因的表达，表明山柰酚治疗可以抑制I/R和H/R诱导的心肌细胞铁死亡的发生。因此，山柰酚对心肌I/R损伤的保护作用，可能是通过抑制心肌细胞铁死亡而发挥作用的。

总之，本研究表明，山柰酚具有减弱SD大鼠心肌I/R损伤的作用，并且山柰酚通过抑制心肌I/R诱导的心肌细胞铁死亡发挥心脏保护作用。表明山柰酚是一种治疗心肌I/R诱导的心肌细胞铁死亡的天然化合物。

基金资助:山西省基础研究计划(自由探索类)项目(No.202203021222340);山西白求恩医院人才引进科研启动金项目(No.2023RC23);山西省中医药管理局科研课题(No.2024ZYYC032);

文章来源:范晶晶,刘孙丽,任洁,等.山柰酚减轻心肌缺血再灌注损伤诱导的心肌细胞铁死亡的作用机制[J].中西医结合心脑血管病杂志,2024,22(15):2755-2760.