根据最新的癌症统计，在过去的20年里，每年与肝癌、肺癌相关的死亡率显著上升[1,2]。当前研究抗肝癌、肺癌药物的重点是开发疗效更好、选择性更强和患者依从性更高的靶向药物[3]。吉非替尼（Gefitinib）被美国食品药品监督管理局批准为治疗肺癌的一线药物[4]，其作用靶标表皮生长因子受体（epidermal growth factor,EGFR）是最常见的用于研发抗肺癌药物的高效靶标[5]。血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR）抑制剂在肝癌中的应用被认为是阻止肝癌细胞生长和扩散的最成功的方法之一[6]。乐伐替尼[7](Lenvatinib）和卡博替尼[8](Cabozantinib）均是VEGFR激酶抑制剂，且母核结构都为喹啉环。

喹啉是药物设计的“特权亚结构”[9,10,11,12]，以喹啉结构作为母核，利用拼接原理引入苯氨基基团，合成了许多具有抗肿瘤活性的苯氨基喹啉衍生物。例如伯舒替尼[13](Bosutinib）被批准治疗慢性髓系白血病；来那替尼[14](Neratinib）、吡咯替尼[15](Pyrotinib）用于抗乳腺癌；培利替尼[16](Pelitinib）可以治疗肺癌。这些化合物在喹啉的不同位置进行不同的修饰，喹啉的6、7位分别与不同的疏水或亲水基团相连，4位与苯胺相连。由于4-苯氨基喹啉的显著抗癌特性，研究人员对2-苯氨基喹啉衍生物的抗癌活性进行研究，发现部分2-苯氨基喹啉衍生物的抗肿瘤活性比4-苯氨基喹啉衍生物强[17,18,19,20]。因此，本文以EGFR抑制剂和VEGFR抑制剂为先导化合物，并采取优势片段对接的策略（图1），利用拼接原理在喹啉的2位上连接苯氨基团，6、7位与不同的亲水基团对接，设计合成了16个新型2-苯氨基喹啉衍生物，并测试其对人肝癌细胞（HepG2）和非小细胞肺癌细胞（A549）的抗增殖活性。

1、仪器与试药

Water Xevo G2-XS TOf型质谱仪（美国沃特世科技有限公司）；AVANCEⅢHD 600 MHz型核磁共振波谱仪（德国布鲁克科技有限公司）；RE-2000B型旋转蒸发仪、DFY-10L型低温恒温反应浴槽、SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵、DB-2BC型真空干燥箱（巩义市予华仪器有限公司）；ZNCL-DL-G2型智能磁力搅拌器（爱博特科技有限公司）；Multiskan MK型多功能酶标仪（Thermo公司）；5415R型高速离心机（Eppendorf公司）；SW-CJ-A-2FD型单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；二氧化碳培养箱（Sheldon Manufacturing inc公司）；人肺癌细胞株A549和人肝癌细胞株Hepg-2由湖南省中药活性物质筛选工程技术研究中心赠予；吉非替尼（河南普赛化工产品有限公司）；乐伐替尼（上海笛柏生物科技有限公司）。实验所用试剂均为市售化学纯或分析纯。

图1 目标化合物的设计理念   

2、方法与结果

2.1 目标化合物的合成

目标化合物T1～T16的合成方案如图2所示，合成路线分为两部分。第一部分，以DL-苯丙氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸为起始原料，经乙酰化、硝化、酯化和还原，得到重要中间体B-DL-5、B-L-5和B-D-5。第二部分，目标化合物以阿魏酸为起始原料，经酯化、苄基化、硝化、成环、脱保护、乙酰化和氯化，得到6-甲氧基-7-乙酰氧基-2-氯喹唑啉（A-8），然后与第一部分中间体B-DL-5、B-L-5和B-D-5以及4-氨基苯甲酸乙酯、4-甲基苯胺、2-甲基-4-甲氧基苯胺、4-溴-2-氟苯胺、3-氯-4-氟苯胺对接得到中间体C-1～C-8，再脱保护得目标化合物T-1～T-8，再对T-8的7位羟基进行修饰，得到目标化合物T-9～T-16。

2.1.1 2-乙酰氨基-3-苯基丙酸（B-DL-2）的制备

DL-苯丙氨酸（15 g,0.091 mol）和水（200 m L）室温搅拌30 min，缓慢滴加饱和的NaOH水溶液，调节溶液的pH值至DL-苯丙氨酸全溶，缓慢滴加乙酸酐（15 m L,0.159 mol）。乙酸酐滴加过程中，由于pH值的改变，DL-苯丙氨酸析出，滴加饱和的NaOH水溶液维持反应液的弱碱性环境（pH=8.0）。室温反应3 h,TLC检测反应完全后，滴加盐酸调节反应液的pH值至2，产物完全析出，抽滤，干燥得白色固体15.8 g，收率：84.0%。

目标化合物B-D-2、B-L-2的合成参照上述方法。

2.1.2 2-乙酰氨基-3-(4-硝基苯基)丙酸（B-DL-3)的制备

在250 m L圆底烧瓶中缓慢加入98%浓硫酸（4.4 m L）和65%～68%硝酸（3.7 m L），控温-10℃搅拌0.5 h，分批加2-乙酰氨基-3-苯基丙酸（4.6 g,0.048 mol）后搅拌5 h，将反应瓶置于室温继续搅拌反应19 h,TLC检测反应完全后，将反应液倒入200 m L冰水中，搅拌，产物析出，抽滤，干燥得白色固体5.2 g，收率：92.8%。

目标化合物B-D-3、B-L-3的合成参照上述方法。

2.1.3 2-乙酰氨基-3-(4-硝基苯基)丙酸甲酯（B-DL-4）的制备

2-乙酰氨基-3-(4-硝基苯基)丙酸(5.2 g,0.024 mol），甲醇（52 m L）加入250 m L圆底烧瓶中，在85℃下搅拌0.5 h后，缓慢滴加98%浓硫酸（0.73 m L），回流反应7 h,TLC检测反应完全后，冷却至室温。减压蒸除甲醇，加乙酸乙酯（150 m L）提取，滴加饱和Na2CO3溶液，调节p H值至7，水相用乙酸乙酯（50 m L×2）萃取，合并有机相，加水（50 m L×2）洗涤，无水硫酸镁干燥有机相4 h。过滤，滤液减压浓缩，得黄色固体4.5 g，收率：83.3%。

目标化合物B-D-4、B-L-4的合成参照上述方法。

2.1.4 2-乙酰氨基-3-(4-氨基苯基)丙酸甲酯(B-DL-5)的制备

将还原铁粉（9.7 g,0.199 mol）、氯化铵（0.6 g,0.013 mol）、乙醇（52 m L）、水（13 m L)和冰醋酸（3 m L）均加入三颈烧瓶中，再置于90℃油浴锅中搅拌反应1.5 h后，加入2-乙酰氨基-3-(4-硝基苯基）丙酸甲酯（4.5 g,0.019 mol）继续加热搅拌反应3 h，经TLC检测反应完全后，趁热抽滤，滤液减压浓缩，加二氯甲烷（150 m L）提取，加水（50m L×2）洗涤，无水硫酸镁干燥有机相4 h。过滤，滤液减压浓缩，得黄白色固体2.6 g，收率：65.0%。

图2 目标化合物的合成方案   

目标化合物B-D-5、B-L-5的合成参照上述方法。

2.1.5 (E)-3-((4-羟基-3-甲氧基)苯基)丙烯酸甲酯(A-2)的制备

阿魏酸（10 g,0.052 mol）溶于甲醇(50 m L),90℃搅拌0.5 h，缓慢滴加98%浓硫酸（1.8 m L），回流反应6 h。TLC检测反应完全后，停止反应。冷却至室温，减压蒸出甲醇，加乙酸乙酯（100 m L），滴加饱和Na2CO3水溶液，调节p H值至7，加水（50 m L×3）洗涤，无水硫酸镁干燥有机相4 h。过滤，减压浓缩，得淡黄色液体10.2 g，收率：95.3%。

2.1.6 (E)-3-((3-甲氧基-4-苄氧基)苯基)丙烯酸甲酯(A-3)的制备

(E)-3-((4-羟基-3-甲氧基)苯基)丙烯酸甲酯（10.2 g,0.049 mol）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF,27.5 m L）、氯化苄（5.3 m L,0.046 mol),K2CO(8 g,0.058 mol),75℃搅拌6 h。TLC检测反应完全后，停止反应。冷却至室温，倒入1 000 m L冰水中搅拌2 h，抽滤，烘干滤饼，得白色固体12.3 g，收率：84.2%。

2.1.7 (E)-3-((5-甲氧基-2-硝基-4-苄氧基)苯基)丙烯酸甲酯(A-4)的制备

(E)-3-((3-甲氧基-4-苄氧基)苯基)丙烯酸甲酯（12.3 g,0.041 mol），冰醋酸（50 m L),60℃搅拌0.5 h后，置于25℃下搅拌，分批缓慢滴加HNO3(24.6 m L），反应温度控制在30℃以下。滴加完HNO3后，继续搅拌0.5 h,TLC检测反应完全后，停止反应。将反应液倒入1 000 m L冰水中搅拌2 h，抽滤得到滤饼，滤饼干燥后得淡黄色固体14 g，收率：98.6%。

2.1.8 6-甲氧基-7-苄氧基-2-喹啉酮(A-5)的制备

(E)-3-((5-甲氧基-2-硝基-4-苄氧基)苯基)丙烯酸甲酯（3.6 g,0.010 mol）、还原铁粉（17.3 g,0.310 mol）、冰醋酸（36 m L）、无水乙醇（36 m L）和浓盐酸HCl(12 d）加入三颈烧瓶中，90℃机械搅拌6 h,TLC检测反应完全后，停止反应。趁热抽滤，减压浓缩，加入二氯甲烷（126 m L）、水（63 m L），搅拌0.5 h，抽滤，滤液用水（50 m L×3）洗涤，抽滤，烘干，得灰白色固体1.6 g，收率：55.2%。

2.1.9 7-羟基-6-甲氧基-2-喹啉酮(A-6)的制备

将6-甲氧基-7-苄氧基-2-喹啉酮（4.0 g,0.014 mol）、冰醋酸（10 m L）、浓HCl(30 m L）均加入反应瓶中，再置于110℃油浴锅中，搅拌反应6 h,TLC检测反应完全后，停止反应。反应液冷却至室温，减压浓缩，加甲醇（10 m L）搅拌1 h后，抽滤，烘干，得粉红色固体2.3 g，收率：85.2%。

2.1.1 0 6-甲氧基-7-乙酰氧基-2-喹啉酮(A-7)的制备

7-羟基-6-甲氧基-2-喹啉酮（2.5 g,0.015 mol）、乙酸酐（36 m L）、吡啶（7.4 m L）置于100℃搅拌1 h后，加入4-二甲氨基吡啶（0.15 g,0.001 mol），继续反应6 h,TLC检测反应完全后，停止反应。反应液冷却至室温，加至200 m L冰水中搅拌2 h后，抽滤，烘干，得黄白色固体2.1 g，收率：70.0%。

2.1.11 2-氯-6-甲氧基-7-乙酰氧基喹啉(A-8)的制备

6-甲氧基-7-乙酰氧基-2-喹啉酮（2.3 g,0.010 mol)溶于氯化亚砜（17.7 m L,0.244 mol),80℃搅拌0.5 h后，滴加加DMF(23 d）。继续反应4 h,TLC检测反应完全后，停止反应。反应液冷却至室温，减压浓缩后，加冰水800 m L，搅拌2 h，抽滤，烘干，得黄色固体2.3 g，收率：92.0%。

2.1.12 2-乙酰氨基-3-(4-((6-甲氧基-7-乙酰氧基喹啉-2-基)氨基)苯基)丙酸甲酯(C-1)的制备

将2-氯-6-甲氧基-7-乙酰氧基喹啉（0.8 g,0.003 mol）以及2-乙酰氨基-3-(4-氨基苯基)丙酸甲酯（1.1 g,0.005 mol）加入反应瓶，再置于160℃油浴锅中搅拌反应2 h,TLC检测反应完全后，停止反应。冷却至室温，加二氯甲烷（50 m L），搅拌2 h，抽滤，烘干，得黄色固体0.6 g，收率：42.8%。

目标化合物C-2～C-8的合成参照上述方法。

2.1.13 2-乙酰氨基-3-(4-((7-羟基-6-甲氧基喹啉-2-基)氨基)苯基)丙酸甲酯(T-1)的制备

2-乙酰氨基-3-(4-((6-甲氧基-7-乙酰氧基喹啉-2-基)氨基)苯基)丙酸甲酯（0.6 g,0.001 mol）、甲醇（10 m L），置于80℃搅拌0.5 h，加入氨水（2 m L），继续反应6 h,TLC检测反应完全后，停止反应。冷却至室温，减压浓缩，加50 m L冰水搅拌，抽滤，烘干，得黄色固体0.4 g，收率：73.5%。

目标化合物T-2～T-8的合成参照上述方法。

2.1.14 2-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-(二甲氨基)丙氧基)喹啉(T-9)的制备

2-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-6-甲氧-7-羟基基喹啉（1 g,0.003 mol）溶于DMF(5 m L），置于95℃搅拌0.5 h，加入碳酸钾（1.3 g,0.009 mol）、碘化钾（0.02 g）和N,N-二甲基-3-氯丙烷（0.46 g,0.004 mol）。继续反应24 h,TLC检测反应完全后，停止反应。冷却至室温，加冰水（50 m L），搅拌2 h，抽滤，烘干滤饼得粗产品。将粗产品溶于甲醇（5 m L），缓慢滴加盐酸，析出白色固体，抽滤，烘干，得黄白色固体1.1 g，收率：84.6%。

目标化合物T-10～T-11的合成参照上述方法。

2.1.15 2-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹啉(D-8)的制备

2-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-羟基-6-甲氧基喹啉（0.6 g,0.002 mol）溶于DMF(2.1 m L），置于75℃搅拌0.5 h，加入碳酸钾（0.54 g,0.004 mol）、碘化钾（0.02 g）和1,3-溴氯丙烷（0.71 m L,0.008 mol）。继续反应6.5 h,TLC检测反应完全后，停止反应。冷却至室温，加冰水（50 m L），搅拌2 h，抽滤，烘干，得白色固体0.6 g，收率：85.7%。

2.1.16 2-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-(二乙氨基)丙氧基)喹啉(T-12)的制备

2-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-氯丙氧基)喹啉（0.7 g,0.002 mol）溶于DMF(4.2 m L），置于95℃搅拌0.5 h，加入碳酸钾（0.31 g,0.002 mol）、碘化钾（0.02 g）和二乙胺（0.37 m L,0.004 mol）。继续反应23 h,TLC检测反应完全后，停止反应。冷却至室温，加冰水（50 m L），搅拌2 h，抽滤，烘干滤饼得粗产品。将粗产品溶于甲醇（5 m L），缓慢滴加盐酸，析出白色固体，抽滤，烘干，得黄白色固体0.4 g，收率：52.6%。

目标化合物T-13～T-16的合成参照上述方法。

2.2 目标化合物的图谱数据

2.2.1 2-乙酰氨基-3-(4-((7-羟基-6-甲氧基喹啉-2-基)氨基)苯基)丙酸甲酯(T-1)

黄色固体，收率：73.5%。1H NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ 7.72 (d,J=8.5 Hz,2H),7.23 (s,1H),7.04 (d,J=8.4Hz,2H),5.96 (d,J=10.0 Hz,1H),5.77 (d,J=8.3 Hz,1H),5.23 (s,1H),4.06-4.01 (m,1H),3.83(s,3H),3.00 (dd,J=11.3,5.1 Hz,1H),2.82 (dd,J=11.5,6.5 Hz,1H),1.78 (s,3H),1.63 (s,3H).HRMS (ESI)C22H23N3O5[M+H]+：理论值410.171 0，实测值410.171 4。

2.2.2 (S)-2-乙酰氨基-3-(4-((7-羟基-6-甲氧基喹啉-2-基)氨基)苯基)丙酸甲酯(T-2)

黄色固体，收率：70.2%。HRMS(ESI)C22H23N3O5[M+H]+：理论值410.171 0，实测值410.171 4。1H NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ 7.70 (d,J=8.2 Hz,2H),7.22 (s,1H),7.03 (d,J=8.2 Hz,2H),5.95 (d,J=10.0 Hz,1H),5.74 (d,J=8.0 Hz,1H),5.23 (s,1H),4.03-4.00(m,1H),3.82 (s,3H),3.00 (dd,J=11.3,5.8 Hz,1H),2.82 (dd,J=11.4,6.4 Hz,1H),1.78 (s,3H),1.24(s,3H)。

2.2.3 (R)-2-乙酰氨基-3-(4-((7-羟基-6-甲氧基喹啉-2-基)氨基)苯基)丙酸甲酯(T-3)

黄色固体，收率：67.5%。HRMS(ESI)C22H23N3O5[M+H]+：理论值410.171 0，实测值410.171 4。1H NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ 7.71 (d,J=8.5 Hz,2H),7.21 (s,1H),7.03 (d,J=8.5 Hz,2H),5.97 (d,J=7.3 Hz,1H),5.74 (d,J=8.0 Hz,1H),5.22 (s,1H),4.04-3.99(m,1H),3.82 (s,3H),3.00 (dd,J=11.4,5.0 Hz,1H),2.82 (dd,J=11.4,6.3 Hz,1H),1.78 (s,3H),1.24 (s,3H)。

2.2.4 4-((7-羟基-6-甲氧基喹啉-2-基)氨基)苯甲酸乙酯(T-4)

白色固体，收率：67.5%。HRMS(ESI)C19H18N2O4[M+H]+：理论值339.133 9，实测值339.130 0。1H NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ 8.06(d,J=8.8 Hz,2H),7.90 (d,J=8.8 Hz,3H),7.14(s,1H),7.06 (s,1H),6.90 (d,J=8.6 Hz,1H),4.28(q,J=7.1 Hz,2H),3.86 (s,3H),1.32 (t,J=7.1Hz,3H)。

2.2.5 2-(对甲苯氨基)-7-羟基-6-甲氧基喹啉(T-5)

白色固体，收率：78.9%。HRMS(ESI)C17H16N2O2[M+H]+：理论值281.128 5，实测值281.200 0。1H NMR(600 MHz,DMSO-d6) δ 7.78 (d,J=8.4 Hz,3H),7.09 (d,J=8.3 Hz,2H),7.04 (s,1H),6.93 (s,1H),6.74 (d,J=8.7 Hz,1H),3.83 (s,3H),2.25 (s,3H)。

2.2.6 2-((2-甲基-4-甲氧基苯基)氨基)-7-羟基-6-甲氧基喹啉(T-6)

白色固体，收率：80.8%。HRMS(ESI)C18H18N2O3[M+H]+：理论值311.139 0，实测值311.136 3。1H NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ 8.10(s,1H),7.77 (d,J=8.8 Hz,1H),7.47 (d,J=8.7Hz,1H),7.06 (s,1H),6.83 (d,J=6.9 Hz,1H),6.77 (d,J=8.6 Hz,1H),6.65 (d,J=8.8 Hz,1H),3.82 (s,3H),3.75 (s,3H),2.19 (s,3H)。

2.2.7 2-((2-氟-4-溴苯基)氨基)-7-羟基-6-甲氧基喹啉(T-7)

HRMS(ESI)C16H12Br FN2O2[M+H]+：理论值363.013 9，实测值363.014 3。白色固体，收率：89.2%。1H NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ 8.73 (d,J=8.0 Hz,1H),7.90 (d,J=8.8 Hz,1H),7.53 (d,J=8.8 Hz,1H),7.38 (d,J=8.1 Hz,1H),7.14 (s,1H),7.07 (d,J=8.8 Hz,1H),7.02 (s,1H),3.85 (s,3H)。

2.2.8 2-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-羟基-6-甲氧基喹啉(T-8)

黄白色固体，收率：85.7%。1H NMR(600 MHz,DMSO-d6) δ 8.49 (d,J=8.3 Hz,1H),7.89 (d,J=8.7 Hz,1H),7.72 (d,J=9.0 Hz,1H),7.34 (t,J=9.1 Hz,1H),7.15 (s,1H),7.05 (s,1H),6.85 (d,J=8.7 Hz,1H),3.85 (s,3H)。

2.2.9 2-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-(二甲氨基)丙氧基)喹啉(T-9)

黄白色固体，收率：84.6%。HRMS(ESI)C21H23Cl FN3O2[M+H]+：理论值404.153 6，实测值404.153 9。1H NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ 8.36 (d,J=8.3 Hz,1H),7.96 (d,J=8.8 Hz,1H),7.84 (d,J=8.0 Hz,1H),7.34 (t,J=9.1 Hz,1H),7.23 (s,1H),7.14 (s,1H),6.92 (d,J=8.7 Hz,1H),4.22 (t,J=5.7 Hz,2H),3.87 (s,3H),3.25 (t,J=7.2 Hz,2H),2.83 (s,6H),2.26-2.20 (m,2H)。

2.2.10 2-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-(二丁氨基)丙氧基)喹啉(T-10)

黄白色固体，收率：51.4%。HRMS (ESI)C27H35Cl FN3O2[M+H]+：理论值488.247 5，实测值488.250 4。1H NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ 8.39 (d,J=8.2 Hz,1H),7.94 (d,J=8.8 Hz,1H),7.80 (d,J=9.1 Hz,1H),7.33 (t,J=9.1 Hz,1H),7.19 (s,1H),7.08 (s,1H),6.89 (d,J=8.8 Hz,1H),4.15 (t,J=6.4 Hz,2H),3.85 (s,3H),2.54 (t,J=6.7 Hz,2H),2.36 (t,J=7.1 Hz,4H),1.91-1.85 (m,2H),1.39-1.33 (m,4H),1.29-1.22 (m,4H),0.83 (t,J=7.3 Hz,6H)。

2.2.11 2-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-吗啉代丙氧基)喹啉(T-11)

黄白色固体，收率：71.4%。HRMS (ESI)C23H25Cl FN3O3[M+H]+：理论值446.164 1，实测值446.164 8。1H NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ 8.31 (d,J=6.8 Hz,1H),7.95 (d,J=8.8 Hz,1H),7.86 (d,J=9.1 Hz,1H),7.34 (t,J=9.1 Hz,1H),7.19 (s,1H),7.11 (s,1H),6.88 (d,J=8.8 Hz,1H),4.16 (t,J=6.4 Hz,2H),3.85 (s,3H),3.59 (t,J=4.3 Hz,4H),2.46 (t,J=7.1 Hz,2H),1.98-1.93 (m,2H),1.31-1.21 (m,4H)。

2.2.12 2-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-(二乙氨基)丙氧基)喹啉(T-12)

黄白色固体，收率：52.6%。HRMS (ESI)C23H27Cl FN3O2[M+H]+：理论值432.184 9，实测值432.187 4。1H NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ 8.34 (d,J=8.2 Hz,1H),7.95 (d,J=8.8 Hz,1H),7.82 (d,J=7.8 Hz,1H),7.34 (t,J=9.1 Hz,1H),7.19 (s,1H),7.10 (s,1H),6.86 (d,J=8.7 Hz,1H),4.15 (t,J=6.4 Hz,2H),3.85 (s,3H),2.56 (t,J=6.9 Hz,2H),2.49-2.46 (m,4H),1.90-1.86(m,2H),0.96 (t,J=7.1 Hz,6H)。

2.2.13 2-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-(二辛氨基)丙氧基)喹啉（T-13)

黄白色固体，收率：67.6%。HRMS(ESI)C35H51Cl FN3O2[M+H]+：理论值600.372 7，实测值600.373 4。1H NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ 8.44 (d,J=8.9 Hz,1H),7.93 (d,J=8.8 Hz,1H),7.78 (d,J=9.1 Hz,1H),7.31 (t,J=9.1 Hz,1H),7.18 (s,1H),7.08 (s,1H),6.89 (d,J=8.8 Hz,1H),4.15 (t,J=6.2 Hz,2H),3.85 (s,3H),2.33 (t,J=6.8 Hz,4H),1.87 (t,J=6.3 Hz,2H),1.38-1.31 (m,4H),1.25-1.20 (m,6H),1.16-1.10 (m,16H),0.76 (t,J=7.0 Hz,6H)。

2.2.14 2-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)喹啉(T-14)

黄白色固体，收率：80.0%。HRMS(ESI)C23H25Cl FN3O2[M+H]+：理论值430.169 2，实测值430.169 6。1H NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ 8.31 (d,J=8.8 Hz,1H),7.95 (d,J=8.8 Hz,1H),7.86 (d,J=10.5 Hz,1H),7.35 (t,J=9.1Hz,1H),7.19 (s,1H),7.1 0 (s,1H),6.87 (d,J=8.8 Hz,1H),4.16 (t,J=6.5 Hz,2H),3.85 (s,3H),2.57 (t,J=7.1 Hz,2H),2.45 (t,J=5.1 Hz,4H),1.98-1.93 (m,2H),1.71-1.68 (m,4H)。

2.2.15 2-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-(哌啶-1-基)丙氧基)喹啉(T-15)

黄白色固体，收率：89.6%。HRMS(ESI)C24H27Cl FN3O2[M+H]+：理论值444.184 9，实测值：444.185 4。1H NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ 8.32 (d,J=8.2 Hz,1H),7.95 (d,J=8.8Hz,1H),7.88 (d,J=7.7 Hz,1H),7.34 (t,J=9.1 Hz,1H),7.20 (s,1H),7.11 (s,1H),6.91 (d,J=8.8 Hz,1H),4.15 (t,J=6.4 Hz,2H),3.85 (s,3H),2.43 (t,4H),1.97 (t,J=6.8 Hz,2H),1.57–1.49 (m,6H),1.27-1.22 (m,2H)。

2.2.16 2-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-(二己氨基)丙氧基)喹啉(T-16)

黄白色固体，收率：72.7%。HRMS (ESI)C31H43Cl FN3O2[M+H]+：理论值544.310 1，实测值544.309 6。1H NMR (600 MHz,DM SO-d6) δ 8.42 (d,J=8.4 Hz,1H),7.95 (d,J=8.8Hz,1H),7.82 (d,J=8.2 Hz,1H),7.33 (t,J=9.1Hz,1H),7.21 (s,1H),7.10 (s,1H),6.92 (d,J=8.7Hz,1H),4.44 (t,J=5.6 Hz,2H),4.20 (s,3H),3.32-3.26 (m,2H),1.32-1.16 (m,16H),0.85 (t,J=8.8 Hz,12H)。

2.3 体外抗肿瘤活性实验

采用CCK-8法测定目标化合物T1～T16对人非小细胞肺癌细胞A549和人肝癌细胞HepG-2的体外抗肿瘤增殖实验，分别以吉非替尼和乐伐替尼为阳性对照药物。将处于对数生长期的A549癌细胞和HepG2癌细胞接种于96孔板中（1×105个/m L），置于37℃、5%CO2条件下的培养箱中贴壁培养24 h，弃去原培养基。分组情况：（1）空白组：含有培养基、CCK-8溶液，不含细胞与药物；（2）正常对照组：含有细胞、培养基、CCK-8溶液，不含药物；（3）药物组：含有细胞、培养基、CCK-8溶液、药物；药物按照浓度梯度0.5、1、5、10、25、50、100μmol·L-1给药（每个药物浓度设6个复孔），每孔100μL，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞培养48 h后，每孔加入CCK-8 10μL培养基，置于培养箱中继续培养1 h后，用酶标仪在450 nm波长下测其OD值，并计算各化合物的IC50值（表1）。  

表1 目标化合物的细胞毒性实验结果

2.4 目标化合物的分子对接

从RCSB蛋白库网站获取EGFR蛋白的X-衍射晶体结构（PDB编号为2I-TY[21]）和VEGFR蛋白的X-衍射晶体结构（PDB编号为3WZD[22]）。利用Autodock软件对活性最好的目标化合物T-7、T-8与VEGFR、EGFR进行分子对接。对接结果如表2所示。目标化合物T-7、T-8与EGFR蛋白和VEGFR蛋白的结合模式图见图3—4,T-7、T-8能很好地插入靶蛋白的结合口袋并与靶蛋白周围的氨基酸残基发生相互作用，主要为疏水作用和氢键作用。目标化合物T-7与3WZD蛋白的氨基酸残基CYS-919形成氢键，苯环部分与ASP-1046、VAL-899、GLU-885形成疏水作用，结合自由能为-5.52 kcal·mol-1，同时其与2ITY蛋白的氨基酸残基MET-793和PRO-794形成氢键，结合自由能为-5.59 kcal·mol-1。目标化合物T-8与2ITY蛋白的氨基酸残基GLU-865、ARG-836形成氢键，T-8结构中的2-苯氨基环与LEU-862和THR-892形成疏水作用，结合自由能为-6.15 kcal·mol-1。目标化合物T-7和T-8的结合能均小于最低结合自由能-5 kcal·mol-1，可推测目标化合物通过抑制EGFR或VEGFR蛋白而发挥抗肿瘤活性。  

表2 目标化合物与靶蛋白分子对接结果 

图3 目标化合物T-7与3WZD(VEGFR）靶蛋白对接结果   

图4 目标化合物与2ITY(EGFR）靶蛋白对接结果  

3、讨论

本文以阿魏酸为原料，经过酯化、苄基化、硝化、成环、脱保护、乙酰化，最后氯化得到中间体A-8，将中间体B-DL-5、B-L-5和B-D-5以及4-氨基苯甲酸乙酯、4-甲基苯胺、2-甲基-4-甲氧基苯胺、4-溴-2-氟苯胺、3-氯-4-氟苯胺引入A-8的2位，并对其7位的乙酰基脱保护后得目标化合物T-1～T-8，然后对T-8进行修饰得到目标化合物T-9～T-16，经1H NMR、LC-MS进行结构表征。

采用CCK-8法，对目标化合物T-1～T-16进行初步的活性筛选，实验结果表明：当喹啉母核2位取代为3-氯-4-氟苯氨基，7位取代基为羟基（T-8）以及不同的烷氧基（T-9、T-10、T-11、T-12、T-13、T-14、T-15、T-16）时，目标化合物T-8抗肿瘤效果最好，其C-7位取代基为羟基；当喹啉母核C-7位取代基为羟基，C-2位取代基为不同的苯氨基（T-1、T-2、T-3、T-4、T-5、T-6、T-7、T-8）时，T-7抗肿瘤效果最好，其2位取代基为2-氟-4-溴苯氨基。同时，目标化合物T-7抗肿瘤活性与吉非替尼以及乐伐替尼相当，T-8的抗肿瘤活性与吉非替尼相当。通过Autodock软件测试目标化合物T-7和T-8与抗非小细胞肺癌相关的EGFR靶点蛋白以及抗人肝癌细胞相关的VEGFR靶点蛋白的结合能力，结果显示目标化合物T-7和T-8与EGFR以及VEGFR蛋白均有较好的结合效果，因此目标化合物可能通过抑制VEGFR或EGFR蛋白而发挥抗肿瘤活性。

本研究设计、合成了一系列2-苯氨基喹啉衍生物，对其喹啉环2位和7位进行结构修饰得到16个目标化合物，并通过1H NMR、LC-MS认证其结构。经体外抗肿瘤活性实验，发现目标化合物T-7和T-8的抗肿瘤活性与阳性对照药吉非替尼以及乐伐替尼相当；分子对接结果显示目标化合物与EGFR、VEGFR靶点具有较好的结合作用，推测目标化合物通过抑制EGFR或VEGFR蛋白而发挥抗肿瘤活性。本研究为进一步开发抗肿瘤药物新型2-苯氨基喹啉类衍生物提供依据。

基金资助:湖南中医药大学药学一流学科开放基金重点项目(2021YX01);

文章来源:宁虎林,郭易华,李凤凤,等.2-苯氨基喹啉衍生物的设计､合成及其抗肿瘤活性研究[J].湖南中医药大学学报,2024,44(05):802-810.