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腹腔注射白消安对精原干细胞代谢特征的影响

2024-05-30 162 上传者：管理员

摘要：目的通过构建白消安处理的小鼠模型，探讨其对小鼠睾丸精原干细胞(SSCs)代谢的影响。方法采用8周龄C57BL/6J雄性小鼠，腹腔注射10 mg/kg白消安，于第0天、第5天和第10天取材，并通过免疫磁珠法分选出Thy1阳性细胞。随后对这些细胞进行了纯度鉴定和代谢组学分析。结果实验发现白消安处理能明显降低小鼠睾丸质量(P<0.05),并损伤睾丸的组织结构。基于主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)模型显示，处理0 d、5 d和10 d的样本组间存在显著的代谢差异。共筛选鉴定出89种差异代谢物，包括谷胱甘肽(GSH)、牛磺酸、精氨酸、必需氨基酸(EAAs)和不饱和脂肪酸(UFAs)等，其重要相关代谢途径涉及甘油磷脂代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等。结论白消安通过影响特定的代谢途径，产生明显的生殖毒性效应，导致小鼠睾丸质量下降和组织结构损伤。代谢组学分析其潜在的生殖毒性机制可能与脂质代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等代谢通路有关。

关键词：
SSCs
代谢组学
生殖毒性
白消安
精原干细胞
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精子发生是一个复杂的过程[1,2],源于睾丸内的精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs),包括精原细胞增殖、精母细胞减数分裂和精子形变，易受多种因素影响。白消安作为一种化疗药物，广泛应用于多种肿瘤治疗及骨髓移植前的骨髓清除[3],同时，可增加精子异常和少精子症发生率，最终导致暂时或永久性不育[4,5],具有自我更新和分化能力的SSCs对其极为敏感[6]。低剂量白消安(如10 mg/kg)可诱导精原细胞数量减少，同时保留一些未分化精原细胞以恢复精子发生[7]。睾丸生精小管的形态学研究发现，在低剂量白消安处理后第2天和第4天精原细胞数量持续减少，而第10天开始启动SSCs再生[8,9]。现有研究主要集中在揭示白消安对男性生殖系统的毒性影响，并探索其解决办法，然而，从代谢组学角度分析化疗后SSCs代谢组变化的研究仍相对较少。

本研究通过使用小鼠模型和液相色谱-质谱(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)技术，旨在深入探究白消安处理下的SSCs代谢变化。采用非靶向代谢组学分析筛选出差异代谢物，这有助于进一步了解白消安对生殖系统的影响，并为未来预防及治疗其所导致的生殖毒性，研发新疗法提供新的信息。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：

8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠[斯贝福(北京)生物技术有限公司]。

1.1.2 主要试剂：

苏木精-伊红染色液(北京索莱宝科技有限公司);白消安、二甲基亚砜(Sigma-Aldrich公司);Anti-CD90.2 MicroBeads mouse(Miltenyi Biotec公司);含DAPI封片剂(武汉赛维尔生物科技有限公司);Anti-CD90.2抗体、Anti-DDX4抗体(Abcam公司)。

1.1.3 仪器与设备：

免疫磁珠分选磁力架、磁性分离柱(Miltenyi公司);倒置荧光显微镜及拍照系统(Lecia公司);Q ExactiveTM HF-X质谱仪、VanquishTM UHPLC色谱仪(Thermo Fisher Scientific 公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物的分组及处理：

将小鼠分笼饲养，适应性喂养1周后，将小鼠随机分为3组，在DMSO中溶解白消安，小鼠腹腔注射单剂量(10 mg/kg)白消安，腹腔注射后于0 d、5 d和10 d通过CO2窒息安乐死，取出睾丸，记录睾丸质量。

1.2.2 原代精原干细胞分离：

将睾丸取出后，去掉外层白膜，加入PBS轻微震荡静置吸出上清，去掉间质细胞，加入胰蛋白酶消化20 min, 期间间歇摇动。消化成单细胞后终止消化，用40 μm孔径滤膜过滤，离心、重悬，加入THY1磁珠，4 ℃避光孵育20 min, 通过分选柱和磁珠分离器分选出THY1阳性的细胞群，液氮速冻，-80 ℃保存。

1.2.3 免疫荧光染色：

将磁珠分选所得阳性细胞混匀吸取部分涂片，加入4%多聚甲醛固定30 min, 用PBS洗3次，每次5 min; 5% BSA室温封闭1 h, 加入兔抗THY1抗体(1∶200)和鼠抗DDX4抗体(1∶500),4 ℃孵育过夜；PBS洗3次，每次5 min; 二抗室温孵育2 h; PBS洗3次，每次5 min; 用含DAPI的封片剂封片，在激光共聚焦显微镜下观察。

1.2.4 精原干细胞代谢物提取：

分选所得细胞样本在4 ℃环境下缓慢解冻，于5×105细胞加入30 μL萃取液(2∶2∶1=甲醇∶乙腈∶水),涡旋混匀，4 ℃静置10 min, 4 ℃ 15 000 rpm离心25 min两次，将上清液转移至进样小瓶，待LC-MS分析。

1.2.5 HE染色：

安乐死后立即取出小鼠的睾丸，在固定液中固定至少24 h, 使用乙醇梯度脱水，二甲苯组织透明化。脱水和透明化完成后，将组织包埋在石蜡中，使用切片机将其切成5 μm厚的切片。切片使用二甲苯脱蜡，乙醇梯度水合，用水冲洗2 min, 苏木精染色5 min, 再用水冲洗10 min。最后，切片用伊红溶液染色2 min。

1.2.6 LC-MS:

为了检测细胞中的代谢物，将Q ExactiveTM HF-X质谱仪与VanquishTM色谱仪耦合，该系统具有电喷雾电离，扫描范围为60～1 000 m/z, 1 Hz, 分辨率为140 000。色谱柱为XBridge BEH Amide(2.1×150 mm, 粒径2.5 μm);使用梯度溶液A(95∶5=水∶乙腈加20 mmol/L乙酸铵和20 mmol/L氢氧化铵，pH 9.45)和溶液B(乙腈)。流速150 μL/min。LC梯度为：0 min, 85% B;2 min, 85% B;3 min, 80% B;5 min, 80% B;6 min, 75% B;7 min, 75% B;8 min, 70% B;9 min, 70% B;10 min, 50% B;12 min, 50% B;13 min, 25% B;16 min, 25% B;18 min, 0% B;23 min, 0% B;24 min, 85% B;进样量5～10 mL,自动进样温度4 ℃。

1.3 统计学分析

Wiff格式的原始数据经ProteoWizard转换成.mzXML格式，然后用XCMS软件进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积鉴定代谢物结构。使用R语言软件进行独立样本t检验、方差分析(ANOVA)等，所有数据表示为平均值±标准差。最终以P<0.05、VIP>1为阈值，筛选差异变量。利用Metabo Analyst 6.0在线数据分析平台对差异代谢物进行聚类分析、通路分析和富集分析。

2、结果

2.1 白消安处理小鼠模型建立

为了探究白消安对雄性小鼠SSCs的代谢影响，并构建相应的动物模型，研究选取8周龄性成熟的C57BL/6J雄性小鼠作为实验对象。在实验中，小鼠通过单次低剂量腹腔注射10 mg/kg白消安，在第0天、第5天和第10天取出小鼠睾丸。通过免疫磁珠法，分选出THY1阳性的细胞进行代谢组学等一系列深入的实验检测(图1A)。

2.2 白消安处理对小鼠睾丸质量和组织学的影响

腹腔注射10 mg/kg白消安后，小鼠睾丸质量在第5天和第10天显著下降(P<0.05)(图1B)。生精上皮厚度自第3天开始出现显著下降(P<0.05),第6天开始出现极显著下降(P<0.001)(图1C)。通过H&E染色观察到睾丸结构出现了不同程度的损伤，曲细精管1～3 d与0 d相比无明显区别，但由于剂量低暂未发现出现空泡的管腔(图1D)。

2.3 磁珠分选所得细胞纯度鉴定

THY1为生殖细胞中SSCs特异表达的细胞膜蛋白，也是目前用于纯化SSCs的可靠指标之一。将磁珠分选所得的THY1阳性细胞涂片，利用免疫荧光染色进一步鉴定细胞纯度，结果显示SSCs分选纯度达85%以上(图2A)。

2.4 白消安处理不同阶段精原干细胞代谢组学数据评估

主成分分析(principal component analysis, PCA)显示，白消安处理0 d、5 d和10 d的SSCs组内样本差异较小，组间差异较大(图2B)。为了减少干扰因素，再次采用偏最小二乘法判别分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)进行整体分析，PLS-DA模型可将3组完全区分开来，组内样本相似度高，组间样本能够被明显区分(图2C)。且PLS-DA模型评价参数Q2>0.5、P<0.05和R2Y≤1(图2D)。

2.5 白消安处理精原干细胞差异代谢物筛选

2.5.1 差异代谢物筛选结果：

基于两种模型构建成功的前提下，为了进一步分析白消安处理后小鼠睾丸SSCs的相关差异代谢物，本研究以变量重要性指标(variable importance in projection, VIP)>1和P<0.05为条件，共筛选鉴定出89种差异代谢物。

2.5.2 差异代谢物整体分布情况：

根据差异代谢物层次聚类分析，小鼠睾丸组织样本可分为两个区域，白消安处理0 d的对照组为第1区域，白消安处理第5天和第10天为第2区域，白消安处理0 d的代谢物相对丰度高于其他两组，且白消安处理第5天和第10天两个组中代谢物相对丰度接近。同时，根据差异显著程度进一步从这些差异代谢物中筛选出前20位差异代谢物。将筛选出的差异代谢物导入Metabo Analyst 6.0在线数据分析平台中进行代谢通路分析，经注释分析，89种差异代谢物被富集在47条代谢通路中，受白消安显著影响的通路包括甘油磷脂代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成以及乙醛酸和二羧酸代谢等。

图1 白消安处理小鼠模型建立

2.6 白消安处理不同时间段精原干细胞差异代谢物分析

差异代谢物数据的K均值(K-means)聚类分析结果如图，所有样品根据白消安处理后不同时间段的变化趋势分为4个簇(图3A)。由图可知，簇1和簇4中的物质变化规律基本一致。簇1在白消安处理过程中第5天下调，第10天稍显上调，主要是脂质，如胆固醇、磷脂酰胆碱和甘油磷脂等，其次是必需氨基酸(essential amino acids, EAAs)如苯丙氨酸和色氨酸；簇2富集到的差异代谢物较少，主要是少部分的脂质和氨基酸；簇3富集的差异代谢物最多，其在第5天下调，在第10天时基本不变，主要是氨基酸，如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸和甘氨酸等，其次是脂质和碳水化合物；还有一部分差异代谢物在第5天下调，在第10天明显上调，主要是脂质，如磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺(图3B)。其中，脂质在生殖细胞发育过程中起着重要作用，此前已有研究表明长链脂肪酸三酰甘油(triglyceride, TG)代谢紊乱可损害雄性生育能力[10,11]。

图2 磁珠分选细胞纯度验证及白消安处理不同阶段SSCs代谢物多元分析

2.7 典型差异代谢物统计分析

抗氧化剂谷胱甘肽(glutathione, GSH)在白消安处理后的第5天极显著下降(P<0.001),而在第10天明显有所回升(P<0.01),另一种抗氧化剂牛磺酸在第5天也出现了极显著下降(P<0.001)(图4A,B)。精氨酸及其他人体EAAs在白消安处理后变化趋势亦然(P<0.001或P<0.01)(图4C,D)。此外，大部分多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)也出现相似现象，即第5天出现极显著下降(P<0.001),第10天极显著回升(P<0.001)(图4E)。

3、讨论

本研究通过建立雄性小鼠生殖毒性模型，评估白消安对SSCs代谢特征的影响。本研究发现10 mg/kg白消安可以显著降低小鼠睾丸质量，这与先前报道的剂量-效应关系相似[12]。组织学结果表明睾丸组织也受到了不同程度的损伤。通过纯化SSCs并进行代谢组学分析，发现白消安处理过程中SSCs在代谢水平上出现显著变化。层次聚类分析和K-means分析揭示了SSCs在不同时间点的代谢物存在独特变化模式。代谢通路分析揭示了几种关键分子变化，特别是甘油磷脂代谢、精氨酸和脯氨酸代谢通路作为关键影响路径，为未来的干预策略提供了依据。GSH、牛磺酸、精氨酸、EAAs以及PUFAs也在白消安处理后发生了显著变化。GSH、牛磺酸变化反映了白消安引起的氧化应激对生殖系统的影响[13];精氨酸及EAAs变化反映了白消安处理后SSCs合成蛋白质和其他生物大分子活动受到影响[14];此外，PUFAs类脂肪酸的降低可能解释了白消安处理后SSCs细胞膜流动性和通透性下降，以及白消安处理后的炎性反应。这些结果表明白消安通过干扰关键的生物化学途径和细胞成分，尤其是那些对抗氧化防御和细胞结构完整性至关重要的成分，对生殖系统产生了负面影响。研究白消安对SSCs代谢特征的影响，不仅能增进对SSCs代谢调控的理解，还可以指导未来的临床研究，如开发新的生殖健康干预策略或治疗方法。此外，了解这些代谢特征的变化也可以为评估环境污染物对人类生殖健康的影响提供实验基础，促进环境保护和人类健康风险评估的发展。因此，研究白消安对SSCs代谢特征的影响不仅具有科学意义，还具有公共卫生和环境保护的重要价值。

图3 差异代谢物的K-means分析

图4 白消安处理过程中典型差异代谢物变化

综上所述，本研究表明白消安能够显著改变小鼠SSCs的代谢特征，并可能通过影响多条代谢通路产生生殖毒性效应。然而，该领域仍需要更多的研究以揭示具体的分子机制和潜在的治疗策略。此外，由于研究使用了特定剂量和特定品系的小鼠，其结果的普适性和临床转换前景还需进一步验证。

基金资助:国家自然科学基金(92268111,32370910);

文章来源:余志鑫,邙新雨,邹定峰,等.腹腔注射白消安对精原干细胞代谢特征的影响[J].基础医学与临床,2024,44(06):793-799.