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乙肝宁颗粒中鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素HPLC法测定的建立

2020-08-26 267 上传者：管理员

摘要：目的：建立HPLC法同时测定乙肝宁颗粒中鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素。方法：采用KromasilC18色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）；流动相：乙腈–0.1%甲酸溶液，梯度洗脱；检测波长分别为238nm（0～21.0min检测鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸和车叶草苷）、280nm（21.0～40.0min检测丹参素、丹酚酸B和丹参酮ⅡA）和254nm（40.0～55.0min检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素）；体积流量：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量为10μL。结果：鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素分别在1.49～37.25、0.76～19.00、1.07～26.75、0.99～24.75、12.61～315.25、2.43～60.75、0.69～17.25、1.86～46.50μg/mL线性关系良好（r≥0.9991）；各成分平均加样回收率分别为98.44%、98.12%、99.36%、97.44%、100.00%、99.19%、96.98%、98.93%,RSD值分别为0.71%、1.47%、0.98%、1.35%、0.85%、1.13%、1.02%、1.29%。结论：该方法操作简便、重复性好，可用于乙肝宁颗粒中多指标性成分的质量控制。

关键词：
丹参素
乙肝宁颗粒
车叶草苷
车叶草苷酸
鸡矢藤次苷甲酯
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乙肝宁颗粒现收载于《中国药典》2015年版一部，由白花蛇舌草、白芍、白术、川楝子、丹参、党参、茯苓、黄芪、金钱草、茵陈、牡丹皮、蒲公英、制何首乌组成，具有补气健脾、活血化瘀、清热解毒的功效，用于胁痛、腹胀、乏力、尿黄等慢性肝炎属脾气虚弱、血瘀阻滞，湿热毒蕴证的治疗，对急性肝炎属上述证候者亦有一定的疗效。多指标成分质量控制模式已逐步应用于中药及其复方制剂的质量控制中，但质量标准[1]和文献报道[2,3,4]中仅对乙肝宁颗粒所含单一成分进行定量研究。本实验选取乙肝宁颗粒方中黄芪所含主要活性成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素，丹参所含特征成分丹参素、丹酚酸B和丹参酮ⅡA以及白花蛇舌草所含代表性成分鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸和车叶草苷为指标，采用HPLC梯度洗脱法实现对乙肝宁颗粒中多指标成分的同时测定，为全面科学地评价乙肝宁颗粒内在质量提供理论基础。

1、仪器与试药

Agilent1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；AP125WD型分析天平（日本Shimadzu公司）；SB-5200DT型超声波提取器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

丹参酮ⅡA（批号110766-201721，质量分数99.5%）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号111920-201606，质量分数97.6%）、丹参素钠（批号110855-201915，质量分数97.8%）和丹酚酸B（批号111562-201716，质量分数94.1%）对照品均购自中国食品药品检定研究院；车叶草苷酸（批号PRF8050928，质量分数98.2%）、车叶草苷（批号PRF8032722，质量分数99.7%）、芒柄花素（批号PRF8091225，质量分数99.9%）、鸡矢藤次苷甲酯（批号PRF8091244，质量分数99.7%）对照品均购自成都普瑞法科技开发有限公司。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯；乙肝宁颗粒由九芝堂股份有限公司提供，规格17g/袋，批号201811001、201902002、201905001。

2、方法与结果

2.1对照品溶液的制备

各精密称取鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、丹参素钠、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素对照品适量，用50%甲醇溶解制成质量浓度分别为0.298、0.152、0.214、0.198、2.522、0.486、0.138、0.372mg/mL的8种单组分对照品贮备液。精密吸取8种单组分对照品贮备液各2.5mL，用50%甲醇溶液制成混合对照品溶液（含鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、丹参素钠、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素分别为14.9、7.6、10.7、9.9、126.1、24.3、6.9、18.6μg/mL）。

2.2供试品溶液的制备

取乙肝宁颗粒适量，除去内包装，研成细粉，精密称取约2.0g，精密加入50%甲醇溶液25mL，称定质量，超声提取30min，放冷后称定质量，用50%甲醇溶液补重，滤过，制成供试品溶液。按《中国药典》2015年版一部乙肝宁颗粒项下的处方工艺分别制备缺白花蛇舌草、丹参、黄芪的阴性样品，按上述方法制成阴性样品溶液。

2.3色谱条件

KromasilC18色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）；流动相A：乙腈，流动相B:0.1%甲酸溶液，梯度洗脱（0～10.0min,23.0%A;10.0～21.0min,23.0%→35.0%A;21.0～40.0min,35.0%→42.0%A;40.0～51.0min,42.0%→48.0%A;51.0～55.0min,48.0%→23.0%A）；检测波长分别为238nm(0～21.0min检测鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸和车叶草苷）[5]、280nm(21.0～40.0min检测丹参素、丹酚酸B和丹参酮ⅡA)[6,7,8]和254nm(40.0～55.0min检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素）[9,10]；体积流量：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量为10μL。

2.4系统适应性试验

精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液进样检测，记录色谱图，结果供试品溶液色谱图中鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素色谱峰峰形对称，各成分分离度均大于1.5，理论塔板数按各成分色谱峰计均大于4000，阴性样品对各成分的测定无干扰，见图1。

图1混合对照品（A）、乙肝宁颗粒（B）、缺白花蛇舌草阴性样品（C）、缺丹参阴性样品（D）和缺黄芪阴性样品（E）的HPLC图谱

2.5线性关系考察

分别精密吸取8种单组分对照品贮备液各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，用50%甲醇溶液制成系列质量浓度混合对照品溶液，依法进样检测鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素的峰面积，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，结果见表1。

表1各成分线性关系

2.6精密度试验

精密吸取混合对照品溶液连续进样6次，测定鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素峰面积，结果峰面积的RSD值分别为1.03%、1.11%、0.99%、1.06%、0.55%、0.76%、1.27%、0.82%。

2.7重复性试验

取批号201811001乙肝宁颗粒样品，平行制备6份供试品溶液，依法进样，测定鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素的峰面积，计算得8种成分质量分数的RSD值分别为1.20%、1.38%、1.41%、1.35%、1.47%、0.96%、0.86%、1.13%。

2.8稳定性试验

取批号201811001乙肝宁颗粒样品，制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、18h进样检测鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素的峰面积，结果8种成分峰面积的RSD值分别为1.01%、1.14%、0.95%、1.03%、0.57%、0.73%、1.25%、0.79%，表明供试品溶液18h内稳定。

2.9回收率试验

取批号201811001乙肝宁颗粒样品，除去内包装，研成细粉，取9份，每份约1.0g，精密称定，随机分成3组，精密加入混合对照品溶液（含鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素0.172、0.114、0.162、0.138、1.854、0.318、0.096、0.252mg/mL)0.5、1.0、1.5mL各1组，制成供试品溶液，依法进样测定鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素的峰面积，计算得8种成分的平均加样回收率分别为98.44%、98.12%、99.36%、97.44%、100.00%、99.19%、96.98%、98.93%,RSD值分别为0.71%、1.47%、0.98%、1.35%、0.85%、1.13%、1.02%、1.29%。

2.10样品测定

取3批乙肝宁颗粒样品适量，除去内包装，研成细粉，每个批次取3份，每份约2.0g，精密称定，制备供试品溶液，依法进样测定鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素的峰面积，采用外标法计算乙肝宁颗粒中8种成分的质量分数，结果见表2。

表2乙肝宁颗粒中鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素的测定结果（n=3)

3、讨论

3.1供试品溶液制备方法的选择

在供试品溶液制备时，参考相关文献首先对比考察了不同提取溶剂（甲醇、70%甲醇溶液、50%甲醇溶液、95%乙醇溶液、70%乙醇溶液、水），以乙肝宁颗粒中鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素的提取率为指标，同时兼顾色谱图中杂质峰的影响，结果显示以50%甲醇溶液为提取溶剂时，8种待测成分提取率最佳，杂质成分干扰较小。依次对不同提取方式（超声提取法、回流提取法）和提取时间（15、30、45min）进行考察，结果显示两种提取方式对8种待测成分综合提取率无显著差异，可能与乙肝宁颗粒中13味中药材均经提取、浓缩的生产制备工艺有关，超声提取30min所测各成分均能提取完全。故最终确定采用50%甲醇超声提取30min对乙肝宁颗粒进行供试品溶液制备。

3.2流动相洗脱系统的选择

实验对乙腈–水、乙腈–0.1%磷酸水溶液[11]、乙腈–0.1%甲酸水溶液[12]3种流动相系统进行考察，以乙肝宁颗粒中鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素的峰形、分离效果和色谱图中基线平稳、杂质干扰为指标，结果显示乙腈–0.1%甲酸水溶液流动相系统优于其他2种流动相体系，通过对流动相中有机相和水相比例的不断摸索，最终确定采用乙腈–0.1%甲酸水溶液流动相系统对乙肝宁颗粒中鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素进行同时检测，在此流动相体系条件下，8种待测成分峰形对称，分离度符合要求，杂质成分干扰较小。

本实验采用HPLC梯度洗脱法对乙肝宁颗粒中鸡矢藤次苷甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素进行了同时测定，建立了乙肝宁颗粒中多指标质量控制模式，所建立的方法操作便捷、专属性强，结果准确，为全面评价乙肝宁颗粒的整体质量提供了参考依据。

参考文献：

[1]中国药典[S].一部.2015:428-429.

[2]张秋蓉,周浓,杨敏.HPLC测定乙肝宁颗粒中川楝素[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(10):78-79,82.

[3]李丹,姜家书,付彬.高效液相色谱法测定乙肝宁颗粒中芍药苷含量[J].河南中医,2010,30(5):450-451.

[4]尹思泳,陈钟扬,梁华伦,等.HPLC法测定乙肝宁颗粒中二苯乙烯苷含量[J].中国民族民间医药,2015,24(15):11-12.

[5]杨培民,曹广尚,李芳,等.基于高效液相色谱-二极管阵列检测法测定白花蛇舌草中5个环烯醚萜成分的含量[J].中国医院药学杂志,2015,35(1):9-12.

[6]翟学佳,徐锦凤.高效液相色谱法同时测定丹参药材水溶性和脂溶性成分的含量[J].医药导报,2009,28(10):1345-1348.

[7]杨菲,王智民,张启伟,等.“一测多评”法测定丹参酚酸类成分的含量[J].中国中药杂志,2011,36(17):2372-2379.

[8]程沛,韩东岐,胡伟慧,等.高效液相色谱法同时测定丹参中10种水溶性和4种脂溶性成分的含量[J].药物分析杂志,2015,35(6):991-996.

[9]付娟,杨世海,黄林芳.超高效液相色谱法同时测定黄芪中6种黄酮类成分的含量[J].中国药学杂志,2013,48(11):916-919.

[10]张妍,董琳,雍婧姣,等.HPLC法同时测定黄芪药材中10种黄酮类成分的含量[J].中国药房,2017,28(21):2970-2973.