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敏性鼻炎大鼠应用孟鲁司特对其鼻黏膜的重塑作用研究

2020-08-27 531 上传者：管理员

摘要：目的研究孟鲁司特对过敏性鼻炎大鼠鼻黏膜重塑及辅助T淋巴细胞1(Th1)/辅助T淋巴细胞2(Th2)失衡的作用。方法采用卵清蛋白致敏法建立过敏性鼻炎大鼠模型,将建模成功的大鼠随机分为模型组、实验组及对照组,各10只。另选取10只大鼠为空白组,在上述建模的各时间点均用等量生理盐水干预。实验组大鼠灌胃孟鲁司特15mg·kg-1,对照组大鼠灌胃地塞米松1mg·kg-1,对照组与模型组灌胃等量生理盐水,每天1次,连续干预14d。用酶联免疫吸附(ELISA)法检测大鼠血清及鼻腔灌洗液中白细胞介素-4(IL-4)及干扰素-γ(INF-γ)水平;用苏木精-伊红(HE)染色观察大鼠鼻黏膜组织病理变化;用蛋白质印迹法检测磷酸化氨基末端蛋白激酶(p-JNK)及转化生长因子-β1(TGF-β1)蛋白表达。结果空白组、模型组、实验组和对照组大鼠血清中IL-4分别为(9.85±0.68),(64.67±3.85),(28.53±2.48),(18.96±2.32)pg·mL-1,INF-γ分别为(69.25±4.35),(22.68±3.71),(55.77±4.66),(59.15±2.54)pg·mL-1;鼻黏膜组织HE染色切片中每个视野中嗜酸性粒细胞(EOS)个数分别为(5.36±2.12),(15.63±4.25),(6.58±1.42),(6.21±1.33)个,腺体上皮细胞直径分别为(9.63±0.42),(20.12±2.53),(12.36±2.54),(9.85±0.45)μm;鼻黏膜组织p-JNK相对表达量分别为0.62±0.10,1.02±0.15,0.85±0.11,0.68±0.08,TGF-β1相对表达量分别为0.12±0.03,0.98±0.14,0.82±0.11,0.66±0.10,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论孟鲁司特可降低过敏性鼻炎大鼠血清及鼻腔灌洗液中IL-4及INF-γ水平,调节Th1/Th2细胞因子平衡,同时降低鼻黏膜组织中p-JNK与TGF-β1蛋白表达,延缓鼻黏膜重塑及疾病进展。

关键词：
T淋巴细胞1/辅助T淋巴细胞2失衡
孟鲁司特
氨基末端蛋白激酶
过敏性鼻炎
鼻黏膜重塑
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过敏性鼻炎又称为变应性鼻炎,主要是由于机体接触并感染致敏原后反复刺激鼻黏膜,导致患者出现流涕、反复喷嚏等临床表现,严重影响患者生活质量,也是诱导患者出现支气管哮喘的高危因素之一[1]。孟鲁司特是临床较为常见的一种非甾体类药物,也是目前治疗过敏性鼻炎、过敏性紫癜、支气管哮喘等的主要药物。本研究旨在探讨孟鲁司特对过敏性鼻炎大鼠的鼻黏膜重塑及T淋巴细胞1/辅助T淋巴细胞2(Th1/Th2)失衡的影响。

材料与方法

1、材料

动物SPF级、SD大鼠,雌雄各半,雄性大鼠5～6周龄,雌性大鼠6～7周龄,体重180～220g,购自山东新华制药有限公司。动物生产许可证号:SCXK(鲁)2018-0007。

药品与试剂孟鲁司特钠片,规格:每片10mg(按孟鲁司特计),批号:S024415,批准文号:国药准字H20064370,四川大冢制药有限公司生产;醋酸地塞米松片,规格0.75mg,批号:181012201,批准文号:国药准字H42021943,远大医药(中国)有限公司生产。卵清蛋白,氢氧化铝粉剂,均为美国Sigma公司生产;酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒,深圳晶美生物工程有限公司广州分公司生产;兔抗鼠磷酸化氨基末端蛋白激酶(p-JNK)及转化生长因子-β1(TGF-β1)抗体,均购自美国Biolegend公司。

仪器BX51光学显微镜,日本Olympus公司产品;MultiskanGO酶标仪,美国ThermoFisher公司产品;PS-9电转仪,大连竞迈科技有限公司产品;Image-Pro-Plus6.0图像分析软件,美国MediaCyberne-tics公司产品;QuantityOne1-D分析软件,美国Bio-Rad公司产品。

2、实验方法

2.1实验动物模型建立

按照参照文献[2]方法,用卵清蛋白致敏法建立过敏性鼻炎大鼠模型:大鼠腹腔注射致敏混悬液1mL(卵清蛋白30mg+氢氧化铝3g)+生理盐水100mL,每天1次,连续注射7d进行致敏。另选取10只大鼠为空白组,在上述建模的过程中均用等量生理盐水干预。建模后,若大鼠出现喷嚏、清鼻涕及搔鼻动作则表示过敏性鼻炎大鼠模型构建成功。

2.2实验动物分组及干预

将建模成功的大鼠随机分为模型组、实验组及对照组,各10只。实验组和对照组大鼠分别灌胃孟鲁司特15mg·kg-1,地塞米松1mg·kg-1,空白组与模型组灌胃等量生理盐水,每天1次,连续干预14d。

2.3以ELISA法检测血清细胞因子水平[3]3]

药物干预结束后,采集大鼠尾静脉血液样本0.5mL,置于1.0mL经4%EDTA钠盐溶液处理的试管中,以3000r·min-1离心5min,分离血浆,用ELISA法检测血浆中白细胞介素-4(IL-4)及干扰素(INF-γ)水平,操作严格按照试剂盒说明书进行。

2.4以ELISA法检测鼻腔灌洗液中细胞因子水平

将各组大鼠腹腔注射麻醉处死后固定,按照参照文献[4]方法,采集鼻腔灌洗液,反复灌洗3次,共回收0.2mL鼻腔灌洗液,用ELISA法检测鼻腔灌洗液中IL-4及INF-γ水平。

2.5以苏木精-伊红(HE)染色观察大鼠鼻黏膜组织病理变化[5]5]

大鼠处死后,将头部组织标本置于10%甲醛固定48h后,并置于20%乙二胺四乙酸钠盐溶液中进行脱钙处理,2周后进行石蜡包埋,自小鼠窦口鼻道复合体位置起进行冠状位连续切片,进行常规HE染色,于光学显微镜下观察大鼠鼻黏膜组织病理改变,于高倍显微镜下计数嗜酸性粒细胞(EOS)数目(标准为细胞有分叶核,细胞质中有嗜酸性颗粒),Image-Pro-Plus6.0图像分析软件测量黏膜下腺体肥大程度(记录腺体上皮细胞直径)。

2.6以蛋白质印迹法检测大鼠鼻黏膜组织p-JNK、TGF-β1蛋白表达[6]6]

取各组大鼠液氮中保存的适量鼻黏膜组织,进行组织匀浆处理,以1.2×104r·min-1离心30min,检测上清液蛋白浓度,并进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳,一抗加入兔抗鼠p-JNK、TGF-β1抗体,4℃孵育过夜,二抗室温孵育20min,以β-actin为内参照,用QuantityOne1-D分析软件进行鼻黏膜组织p-JNK、TGF-β1蛋白相对表达量。

3、统计学处理

用SPSS21.0软件进行统计分析。计量资料用x¯±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,符合正态分布时,2组间比较用LSD-t检验;不符合正态分布时,用秩和检验分析。

结果

1、各组大鼠血清及鼻腔灌洗液中细胞因子水平比较

与空白组比较,模型组大鼠血清及鼻腔灌洗液中IL-4水平升高,且实验组和对照组低于模型组,其中实验组高于对照组;模型组大鼠血清及鼻腔灌洗液INF-γ水平较对照组降低,且实验组和对照组高于模型组,其中实验组鼻腔灌洗液INF-γ水平低于对照组(均P<0.05),见表1。

表1各组大鼠血清及鼻腔灌洗液中细胞因子水平比较

2、各组大鼠鼻黏膜组织病理变化

HE染色显示,空白组大鼠鼻黏膜组织结构正常,未见明显的EOS浸润;模型组大鼠可见鼻黏膜血管扩张、水肿,同时伴有大量EOS浸润;实验组及对照组大鼠鼻黏膜血管轻度扩张,稍有水肿,EOS浸润较模型组明显减轻。

与空白组比较,模型组大鼠鼻黏膜组织中EOS增多,腺体上皮细胞直径增大(P<0.05),实验组和对照组鼻黏膜组织中EOS低于模型组;腺体上皮细胞直径小于模型组,实验组腺体上皮细胞直径大于对照组(均P<0.05),见表2。

3、大鼠鼻黏膜组织p-JNK、TGF-β1蛋白表达

空白组、模型组、实验组和对照组大鼠鼻黏膜组织p-JNK相对表达量分别为0.62±0.10,1.02±0.15,0.85±0.11,0.68±0.08,TGF-β1相对表达量分别为0.12±0.03,0.98±0.14,0.82±0.11,0.66±0.10;模型组大鼠鼻黏膜组织p-JNK、TGF-β1蛋白相对表达量高于空白组,而实验组和对照组均低于模型组,实验组高于对照组(均P<0.05)。

表2各组鼻黏膜组织嗜酸性粒细胞(EOS)及腺体上皮细胞直径比较

讨论

INF-γ和IL-4分别是Th1及Th2型细胞的代表性因子,参与了过敏性鼻炎的发病,且Thl/Th2比例失衡可能是引起过敏性鼻炎发病的重要原因[7]。本研究中,与空白组比较,模型组大鼠血清及鼻腔灌洗液中IL-4水平升高,INF-γ水平降低,提示过敏性鼻炎大鼠普遍存在Th1/Th2失衡的现象,干预后实验组和对照组IL-4低于模型组,INF-γ高于模型组;提示孟鲁司特钠可恢复Th1/Th2的平衡状态。

过敏性鼻炎模型大鼠的鼻黏膜重塑病理表现为鼻黏膜表面纤毛不完整,上皮细胞及细胞间质水肿明显,黏膜下层血管扩张明显,管腔周围出现以嗜酸性细胞为主的炎性细胞浸润[8]。本研究中,实验组和对照组鼻黏膜组织中EOS低于模型组,病理表现均较模型组减轻,提示孟鲁司特可改善过敏性鼻炎大鼠鼻黏膜组织病理学形态,延缓鼻黏膜重塑过程。JNK是丝裂原活化蛋白激酶超家族成员,是重要的细胞信号分子之一,通过其氨基末端残基磷酸化活化后参与细胞增殖、凋亡。研究显示,JNK信号途径蛋白p-JNK在过敏性鼻炎大鼠鼻黏膜重塑组织中表达显著增高,参与了大鼠鼻黏膜组织重塑的进程[9]。TGF-β1可调节细胞因子的分泌与炎性介质水平[10],从而促进胶原合成、血管生成、平滑肌细胞迁移及增生等,青蒿琥酯干预后可显著降低哮喘大鼠肺组织TGF-β1表达。本研究结果中,模型组大鼠鼻黏膜组织p-JNK、TGF-β1蛋白相对表达量高于空白组,而实验组和对照组均低于模型组,提示孟鲁司特可降低过敏性鼻炎大鼠鼻黏膜组织中p-JNK与TGF-β1蛋白表达,进而延缓鼻黏膜重塑及疾病进展。

参考文献：

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