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森登-4汤对修复膝关节骨性关节炎家兔的软骨胶原纤维结构平衡的作用机制研究

2020-09-29 364 上传者：管理员

摘要：目的：探讨森登-4汤对膝关节骨性关节炎(KOA)家兔的软骨组织Ⅱ型胶原蛋白(ColⅡ)、基质金属蛋白酶13(MMP-13)、MMP-9和基质金属蛋白酶组织抑制剂3(TIMP-3)的影响。方法：用改良Hulth法建立家兔KOA模型。按照体重将家兔随机分为4组:模型组、实验组、阳性对照组和假手术组,每组8只。模型建立后,阳性对照组灌胃壮骨关节丸混悬液0.51g•kg-1,实验组灌胃蒙药森登-4汤水煎液0.43g•kg-1。给药4周后,取关节软骨组织,以免疫组织化学法检测ColⅡ表达(光密度比值);蛋白质免疫印迹法检测MMP-9、MMP-13和TIMP-3蛋白表达(灰度值比值)。结果：假手术组、模型组、阳性对照组和实验组ColⅡ蛋白表达分别为0.11±0.02,0.01±0.00,0.07±0.01和0.08±0.01;这4组的MMP-9蛋白表达分别为0.46±0.16,3.79±1.11,0.97±0.38和0.95±0.31;这4组的MMP-13蛋白表达分别为0.43±0.16,5.97±0.84,0.89±0.67和0.98±0.56;这4组的TIMP-3蛋白表达分别为3.92±0.75,0.30±0.13,1.54±0.73和1.60±0.99。上述指标:模型组与假手术组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01);阳性对照组、实验组与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论：森登-4汤通过调节MMPS/TIMP通路达到修复软骨胶原纤维结构平衡,阻断KOA疾病的发展。

关键词：
Ⅱ型胶原蛋白
基质金属蛋白酶
膝关节骨性关节炎
药学
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随着我国社会老龄化,膝关节骨性关节炎的患病逐年增加。蒙药森登-4汤来源于《观者之喜》,用于治疗关节黄水病(关节炎)、水肿和类风湿等疾病[1]。本实验研究森登-4汤对KOA家兔的软骨组织Ⅱ型胶原蛋白基质金属蛋白酶13、MMP-9和基质金属蛋白酶组织抑制剂3的影响。

材料与方法

1材料

动物6月龄雄性SPF级日本大耳白家兔,体重2.5～3.0kg,购自辽宁长生实验动物中心。动物许可证号:SCXK(辽)-2015-0001。

药品与试剂森登-4汤,规格:每袋15g,批准文号:内药制字M13060391,批号:20180635,由内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室提供;壮骨关节丸,规格:每袋6g,批准文号:国药准字:Z44023377,批号:1803002S,华润三九医药股份有限公司生产。Ⅱ型胶原抗体购,自中国Proteintech公司;MMP-9、MMP-13和TIMP-3抗体,均购自美国Abcam公司。

仪器DM2500光学显微镜,德国Leica公司产品;FUSIONFX凝胶成像系统,购自北京五洲东方科技发展有限公司。

2实验方法

2.1KOA家兔模型制备

参照文献[2]方法操作,切断家兔右后膝关节内侧副韧带、前交叉韧带,切除内侧半月板后逐层缝合。假手术组8只,切开关节腔后缝合。手术1周后,每日驱赶30min,共4周。

2.2分组、给药[3]3]和取样

将造模成功家兔随机分为3组:模型组、实验组和阳性对照组,每组8只;另有假手术组8只。

手术建立模型4周后,开始给药。阳性对照组灌胃壮骨关节丸,按体重每日给予0.51g·kg-1;实验组灌胃给予蒙药森登-4汤水煎液,每日0.43g·kg-1;假手术组和模型组灌胃给予等体积蒸馏水,持续4周。空气栓塞法处死家兔,取关节软骨组织。

2.3以蛋白质印迹法检测家兔右侧膝关节软骨MMP-9、MMP-13和TIMP-3蛋白表达

按照剂盒法抽提蛋白质,用酶标仪562nm处测定光密度(OD)值并计算蛋白浓度,蛋白质进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,参照文献[4]方法操作,超敏化学发光试剂显色,凝胶成像系统拍照,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参蛋白,用凝胶成像系统对蛋白质表达的灰度条带进行计分,以样品灰度值/自身GAPDH灰度值进入统计学分析。

2.4以免疫组化法检测家兔右后膝关节软骨ColⅡ表达变化

取各组家兔右后膝关节软骨组织,脱钙、经中性福尔马林固定、梯度乙醇脱水、石蜡包埋,切片5μm,参照文献[5]方法操作,于光学显微镜下拍照,以阳性表达棕黄色区域光密度值/总区域光密度值为最终量化值,对阳性表达区域OD进行扫描,进行统计分析。

3统计学处理

用SPSS20.0软件进行数据分析,计量资料以表示,组间比较用单因素方差分析。

结果

1几组家兔右后膝关节软骨中MMP-9、MMP-13和TIMP-3蛋白表达比较

模型组与假手术组比较,MMP-9、MMP-13均显著增加、而TIMP-3则显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.01);阳性对照组、实验组与模型组比较,上述指标的差异均有统计学意义(均P<0.01),见表1。

2几组家兔右后膝关节软骨组织ColⅡ蛋白表达变化

假手术组、模型组、实验组和阳性对照组ColⅡ蛋白表达分别为0.11±0.02,0.01±0.00,0.08±0.01和0.07±0.01。模型组与假手术组比较,显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);阳性对照组、实验组与模型组比较,上述指标的差异均有统计学意义(均P<0.01),见图1。表明阳性药和实验药治疗后明显上调软骨组织ColⅡ蛋白表达。

表1各组家兔家兔膝关节软骨组织的MMP-9、MMP-13和TIMP-3水平比较

图1光学显微镜下观察软骨组织的Ⅱ型胶原蛋白(ColⅡ)蛋白表达(×400)

讨论

KOA发病机制是力学和生物学等因素的共同作用下,软骨细胞、细胞外基质(extracellualrmatrix,ECM)和软骨下骨三者之间分解和合成代谢失衡,引起软骨丧失所致疾病[6]。MMP-9在软骨深层表达较高,在KOA早期表达增高明显;MMP-13在OA软骨细胞中高表达,裂解Ⅱ型胶原[7]。KOA时MMPs的增加大于TIMPs的增加时,呈现MMP/TIMP失衡,引起关节软骨基质胶原纤维网及蛋白多糖的降解,导致软骨退变[8]。

本研究中,森登-4汤通过上调TIMP-3的表达,抑制KOA组织中MMP-9、MMP-13的高表达,抑制或延缓ColⅡ胶原蛋白降解,保护软骨细胞外基质ECM,维持软骨结构平衡,达到治疗KOA的作用。

参考文献：

[1]巴根那,图娅,锡光.蒙医方剂学[M].呼和浩特:内蒙古人民出版社,2007:148.

[2]肖春苟,邹锦慧,李力强,等.以改良Hulth法建立兔膝骨性关节炎关节软骨的病理变化[J].中国中医骨伤科杂志,2014,22(12):1-3.

[3]刘恩岐,尹海林,顾为旺.医学实验动物学[M].北京:科学技术出版社,2008:129-130.

[4]马文丽,李凌.分子生物学实验手册[M].北京:人民军医出版社,2011:227.

[5]何建芳,韩安家,吴秋良.实用免疫组化病理诊断[M].北京:科学出版社,2018:267.

[6]孙志涛.鹿茸归经靶向调控骨关节炎TGF-P/Smads信号通路机制研[D].广东广州:广州中医药大学,2013.

[7]郭常安,陈峥嵘,张秀荣.骨性关节炎基质金属蛋白酶1,2,3及其抑制物的表达与软骨退变的关系[J].复旦学报(医学版),2002,4(29):244.

[8]游必凯.中药防治骨性关节炎实验研究进展[J].医学综述,2010,16(2):295-297.

金刚,赵巴根那,包海金,吉白格力玛,额希宝力道,徐艳华.森登-4汤对修复膝关节骨性关节炎家兔的软骨胶原纤维结构平衡的作用机制研究[J].中国临床药理学杂志,2020,36(18):2880-2882.