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胄叶线蕨不同部位提取物的抗炎镇痛作用研究

2020-11-27 387 上传者：管理员

摘要：目的：探讨胄叶线蕨不同溶剂提取物的抗炎活性。方法：选取SPF级雄性昆明小鼠240只，根据实验需要分为模型组、阳性药物组（布洛芬组、地塞米松组）、胄叶线蕨乙醇提取部位组、胄叶线蕨正丁醇提取部位组、胄叶线蕨乙酸乙酯提取部位组，采用醋酸扭体法对胄叶线蕨不同部位提取物的镇痛作用进行研究，采用二甲苯致小鼠耳肿胀、角叉菜胶致小鼠后足跖肿胀、醋酸致毛细血管通透性增加实验、棉球致小鼠肉芽肿形成等模型观察其抗炎活性，分析胄叶线蕨乙醇提取部位、正丁醇提取部位、乙酸乙酯提取部位的抗炎镇痛作用。结果：胄叶线蕨乙醇提取部位组、正丁醇提取部位组小鼠扭体次数少于模型组，耳肿胀度、足跖肿胀度、光密度值低于模型组、肉芽肿系数低于模型组（P<0.05）。胄叶线蕨乙醇提取部位组、胄叶线蕨正丁醇提取部位组对醋酸致小鼠疼痛抑制率分别为56.99%、69.84%，对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制率分别为32.16%、36.49%。在棉球致肉芽肿形成实验中，胄叶线蕨正丁醇提取部位组肿胀抑制率为26.96%。结论：胄叶线蕨具有明显的抗炎镇痛作用，其活性主要集中于正丁醇提取部位。

关键词：
抗炎
提取溶剂
胄叶线蕨
镇痛
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胄叶线蕨又名三枝枪，系水龙骨科植物胄叶线蕨的全草。生于海拔约350m的溪边、林下、林缘。分布于赤水[1]，具有清热解毒的药理作用，主要用于治疗创伤感染[2]。研究发现，与胄叶线蕨同科的植物抱石莲、骨碎补等的抗炎作用[3,4]。已见有报道，而胄叶线蕨仅为抗炎疗效明确的民间用药[5]。在国内外近年文献中鲜有见到有关胄叶线蕨抗炎镇痛作用的研究报道。胄叶线蕨资源丰富，且是一种富含生物活性物质，药用、经济价值可观，尚未充分挖掘的天然药物，值得深入研究开发。本研究旨在探讨胄叶线蕨不同溶剂提取物的抗炎镇痛作用，现报道如下。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

选取SPF级雄性昆明小鼠240只，体质量20～22g，购于长沙市天勤生物技术有限公司，实验动物使用许可证号：SCXK（湘）2016-0008。

1.1.2主要试剂与药品

胄叶线蕨全草采集于郴州市郊区，经邵阳学院段东林教授鉴定；芦丁标准品（中国药品生物制品检定所）；布洛芬片（生产厂家：山西振东泰盛制药有限公司，生产批号：20161002）；地塞米松（天津金耀药业有限公司，生产批号：16050314））；伊文思兰（生产批号：MKCB2532V）；其他试剂均为分析纯。

1.1.3主要仪器与设备

SA紫外分光光度计（上海棱光技术有限公司）；超声波清洗器7500型（浙江仪器设备有限公司）；旋转蒸发仪，型号：RE-52AA，上海垒固仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1胄叶线蕨不同溶剂提取物的制备

药材全草用水洗净，55℃鼓风干燥48h，冷却后粉碎过筛，石油醚脱脂2h，药渣真空干燥至恒重，以70%乙醇20倍量浸泡60min,45℃下超声处理（功率为400W），重复提取2次，45min/次，合并滤液，蒸发干燥得乙醇提取部位；用蒸馏水稀释醇提物，乙酸乙酯萃取后回收下层溶液，旋转蒸发干燥，得乙酸乙酯提取部位；上层滤液经正丁醇萃取，浓缩干燥得正丁醇提取部位。

1.2.2对醋酸致小鼠扭体反应的影响

将雄性小鼠随机分为5组，每组10只，分别为模型组（蒸馏水）、布洛芬组（布洛芬，100mg/kg）、胄叶线蕨组（乙醇提取部位组、正丁醇提取部位组、乙酸乙酯提取部位组，50g/kg），给药1h后腹腔注射0.6%冰醋酸0.2ml/只，观察小鼠腹壁收缩，骨盆旋转，后肢伸展。并记录小鼠15min内出现的扭体次数，计算镇痛率。镇痛率=（模型组平均扭体次数-给药组平均扭体次数）/模型组平均扭体次数×100%。

1.2.3对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

给药方法、分组及剂量同“1.2.2项”，地塞米松组给予地塞米松（5mg/kg），各组给药后1h，分别精密吸取二甲苯10μl均匀涂布于各组小鼠左耳上、下两面，右耳不涂作对照。30min后采用颈椎脱臼法处死小鼠，沿小鼠耳廓基线剪下两耳，采用6mm直径打孔器于左右耳对称部位打下耳片，用精密电子天平称取耳质量，计算耳肿胀度和耳肿胀抑制率。耳肿胀度=（左耳质量-右耳质量）/右耳质量×100%。耳肿胀抑制率（%）=（模型组耳肿胀度-给药组耳肿胀度）/模型组耳肿胀度×100%。

1.2.4对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀的影响

按“1.2.3”方法进行分组及给药。末次给药1h后，除正常组外，其他各组小鼠于左后肢足掌心皮内注射1%的角叉菜胶0.05ml，正常组注射0.9%氯化钠溶液，致炎1h后分别容积法测量小鼠左后足跖的体积。右后足跖与左后足跖体积之差即为肿胀度。足跖肿胀度=（左足跖质量-右足跖质量）/右足跖质量×100%。足跖肿胀抑制率（%）=（模型组足跖肿胀度-给药组足跖肿胀度）/模型组足跖肿胀度×100%。

1.2.5对醋酸致毛细血管通透性增加的影响

按“1.2.3”方法进行分组及给药。末次给药1h后，给小鼠静脉内注射10ml/kg的1%EvansBlue染料盐水溶液，然后腹膜内注射10ml/kg的0.7%醋酸。20min后采用颈脱位法处死小鼠，5ml0.9%氯化钠溶液洗涤收集腹膜液，经3000r/min离心15min。使用分光光度计在590nm检测上清液的吸光度。

1.2.6对棉球致肉芽肿形成的影响

制备无菌棉球（10±0.5)mg并浸入青霉素钠溶液。按“1.2.3”方法进行分组及给药，连续7d。第1天末次给药1h后，将无菌棉球皮下植入到小鼠双侧腹股沟区域，7d后处死小鼠，然后将棉球及周围的肉芽组织小心剥离，60℃下干燥至恒重，测定干重。通过比较试验组和对照组的平均干重来计算抑制率。肉芽组织重量（mg）=剥离物干重（mg）-棉球质量（mg）。肉芽肿系数=肉芽肿重量（mg）/小鼠体质量（g）。肿胀抑制率（%）=（对照组肉芽组织平均重量-给药组肉芽组织平均重量）/对照组肉芽组织平均重量×100%。

1.3观察指标

分析胄叶线蕨乙醇提取部位、正丁醇提取部位、乙酸乙酯提取部位的抗炎镇痛作用。

1.4统计学方法

采用SPSS19.0统计学软件进行数据处理，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验；计数资料以相对数表示，采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1胄叶线蕨组不同溶剂提取物对醋酸致小鼠扭体反应的影响

5组小鼠扭体次数比较，差异有统计学意义（F=17.65,P=0.037）。布洛芬组、胄叶线蕨乙醇提取部位组、胄叶线蕨正丁醇提取部位组小鼠扭体次数少于模型组，差异有统计学意义（P值分别为<0.001、0.009、0.002）。胄叶线蕨乙醇提取部位组、胄叶线蕨正丁醇提取部位组疼痛抑制率分别为56.99%和69.84%。胄叶线蕨乙酸乙酯提取部位组小鼠与模拟组扭体次数比较，差异无统计学意义（P=0.127）。见表1。

2.2胄叶线蕨组不同溶剂提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

5组小鼠耳肿胀度比较，差异有统计学意义（F=36.54,P=0.015）。地塞米松组、胄叶线蕨乙醇提取部位组、胄叶线蕨正丁醇提取部位组耳肿胀度低于模型组，差异有统计学意义（P值分别为<0.001、0.017、0.011）。胄叶线蕨乙酸酯提取部位组与模型组耳肿胀度比较，差异无统计学意义（P=0.354）。见表2。

表1胄叶线蕨组不同溶剂提取物对醋酸致小鼠扭体反应的影响

表2胄叶线蕨组不同溶剂提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

2.3胄叶线蕨组不同溶剂提取物对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀的影响

5组小鼠足跖肿胀比较，差异有统计学意义（F=21.84,P=0.024）。地塞米松组、胄叶线蕨乙醇提取部位组及胄叶线蕨正丁醇提取部位组小鼠足跖肿胀度低于模型组，差异有统计学意义（P值分别为<0.001、0.021、0.013）。乙酸酯提取部位组与模型组小鼠足跖肿胀度比较，差异无统计学意义（P=0.249）。见表3。

表3胄叶线蕨组不同溶剂提取物对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀的影响

2.4胄叶线蕨组不同溶剂提取物对醋酸致毛细血管通透性增加的影响

5组小鼠光密度值比较，差异有统计学意义（F=36.48,P=0.016）。地塞米松组、胄叶线蕨乙醇提取部位组、胄叶线蕨正丁醇提取部位组、胄叶线蕨乙酸乙酯提取部位组光密度值低于模型组，差异有统计学意义（P值分别为=0.002、0.037、0.028和0.045）。见表4。

2.5胄叶线蕨组不同溶剂提取物对棉球致肉芽肿形成的影响

5组小鼠肉芽肿系数比较，差异有统计学意义（F=21.67,P=0.032）。地塞米松组、胄叶线蕨乙醇提取部位组、胄叶线蕨正丁醇提取部位组、胄叶线蕨乙酸乙酯提取部位组肉芽肿系数低于模型组，差异有统计学意义（P值分别为0.002、0.031、0.018和0.042）。见表5。

表4胄叶线蕨组不同溶剂提取物对乙酸致毛细血管通透性增加的影响

表5胄叶线蕨组不同溶剂提取物对棉球致肉芽肿形成的影响

3、讨论

本研究选择乙酸诱导的扭体反应以观察镇痛作用。在醋酸诱导的扭体实验中，胄叶线蕨乙醇提取部位、正丁醇提取部位显示出明显的镇痛作用，与对照组相比抑制率分别为56.99%和69.84%，提示其均具有一定镇痛活性。

在评估抗炎作用时，主要是对提取物在急性期和慢性期所具有抗炎症活性进行评估。本研究选择4种动物模型进行抗炎作用评估，采用二甲苯诱导的小鼠耳肿胀和角叉菜胶诱导的足跖肿胀来评估急性抗炎活性。已有研究表明，二甲苯诱导耳肿胀和角叉菜胶引起的足跖肿胀可能与某些化学物质诱发的神经源性水肿相关，例如组胺、5-羟色胺、缓激肽、P物质和前列腺素等[6]。本研究结果表明，胄叶线蕨乙醇提取部位、正丁醇提取部位可明显抑制角叉菜胶诱导的足跖肿胀、二甲苯诱导的小鼠耳朵肿胀。醋酸是另一种急性炎症模型。醋酸可引起化学递质，例如前列腺素E2(PGE2），组胺和腹膜内血清素的增加，导致血管通透性增加[7]。胄叶线蕨乙醇提取部位、正丁醇提取部位显著抑制醋酸诱导的小鼠血管通透性增加。这些结果提示胄叶线蕨乙醇提取部位、正丁醇提取部位具有显著的抗炎活性，尤其是在炎症的急性期，该活性可能与抑制炎症的化学递质有关。棉花致肉芽肿形成是一种慢性炎症的模型，其干重与肉芽肿组织的形成相关。实验结果表明，胄叶线蕨乙醇提取部位、正丁醇提取部位可有效减少棉球肉芽肿，提示胄叶线蕨乙醇提取部位、正丁醇提取部位在慢性期具有抗炎作用。

综上所述，胄叶线蕨乙醇提取部位、正丁醇提取部位能减少小鼠扭体次数、抑制小鼠耳廓肿胀度和足跖肿胀度，能降低小鼠毛细血管通透性增加，能有抑制小鼠肉芽肿形成，提示胄叶线蕨醇提取物、正丁醇提物可以通过抗急性炎症达到镇痛的作用，其活性成分主要集中在胄叶线蕨正丁醇提取物，但本研究尚未确定和阐明涉及的机制，因此可能是后续研究的重点。

参考文献：

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张伟,唐伟军,王岐本,程庆,张天杰,欧秋娟.胄叶线蕨不同部位提取物的抗炎镇痛作用研究[J].临床合理用药杂志,2020,13(33):11-13+16.