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UPLC-MS/MS法同时测定红参浸膏中人参皂苷含量

2024-12-02 95 上传者：管理员

摘要：建立一种高效液相色谱与串联质谱联用的方法，同时检测红参浸膏中20种人参皂苷的含量。本研究采用70%甲醇溶液提取红参浸膏中的人参皂苷成分；色谱分析使用规格为2.1mm×100mm、粒径1.8μm的Shim-pack Velox C18色谱柱，流动相由0.01%甲酸水溶液和0.01%甲酸乙腈溶液组成，流速为0.4mL•min-1,色谱柱温度为45℃,进样量为1μL,采用二元线性梯度洗脱方式；质谱分析采用电喷雾离子源（ESI）,选择负离子电离模式（ESI-）,并使用动态多反应监测模式（sMRM）进行检测；并利用此方法测定红参浸膏中20种人参皂苷的含量。结果表明，在质量浓度为0.1～30μg•mL-1的范围内，20种人参皂苷有良好的线性相关性，相关系数r均大于0.999,定量限为0.003～0.04μg•mL-1,检出限为0.01～0.12μg•mL-1;该方法的重复性、稳定性、精密度和回收率均良好，其相对标准偏差（RSD）为0.43%～4.89%,回收率为87.12%～109.98%。甲、乙、丙3家公司的红参浸膏中20种人参皂苷总含量分别为42.86508g•kg-1、89.99703g•kg-1、48.43107g•kg-1。本研究建立了一种同时检测红参浸膏中20种人参皂苷的含量的高效液相色谱与串联质谱联用的方法。该方法具有高灵敏度和强选择性，能够快速分离并准确定量红参浸膏中20种人参皂苷化合物，其线性范围、精确度、回收率和稳定性均表现良好。

关键词：
UPLC-MS/MS
人参皂苷
延缓衰老
抑制炎症
红参浸膏
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人参是中华文化中备受推崇的天然产品，在保健养生和烹饪领域都有广泛应用[1]。随着社会发展，中药保健食品逐渐步入人们生活当中，人参及其制品因富含多种营养成分被加工为各类食品，如鲜参直接食用、制成饮品或晒干入酒、煮熟食用以及炮制成红参等[2]。红参具有卓越的药用价值和丰富的营养成分而广受瞩目，人参皂苷是红参中的主要活性成分之一，具有缓解疲劳、延缓衰老以及抑制炎症等多方面的药理功效。人参皂苷含量的精确测定对红参浸膏的质量评估至关重要。研究一种能够同时分析多种成分的方法，对于有效控制其品质[3]、控制生产工艺和指导合理使用都具有重要意义。目前，人参皂苷的测定方法通常以高效液相色谱为主[4-7],但存在分离效率低、操作繁琐、分析周期长等缺点。UPLC-MS/MS无需对大部分组分实现完全的基线分离，而是通过选择性提取特定离子对来实现精确定量，显著减少了分析所需时间。因此，该技术在中药复杂成分的同时定量分析中正得到越来越广泛的应用[3]。本研究不仅为红参浸膏的品质管理提供技术支持，还为人参皂苷的检测方法提供思路和途径，在理论和实际应用方面具有一定的价值和潜力。

1、材料和方法

1.1实验仪器与材料

API 4000+型超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪：美国AB SCIEX;CPA225D型电子天平：德国赛多利斯；Happy-TL21型台式离心机：济南福的；KQ-500DV型超声波清洗器：昆山超声仪器；甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯):美国Fisher;甲酸(色谱纯):天津科密欧；人参皂苷标准物质Rh1、Rg2、Ro、Rd、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5、20(S)-Rg3、Rg1、Rf、Rc、Rb2、Rb3、Rh2、Rb1、Re、F1、Rg6、F2、CK(纯度≥95%):上海源叶；样品是采购市面上销售的甲、乙、丙公司的红参浸膏产品。

1.2标准溶液配制

1.2.1标准储备液

精确称量人参皂苷标准物质，甲醇溶解定容，配制成质量浓度为1000μg·mL-1的人参皂苷标准储备溶液。

1.2.2混合标准工作液

精确量取各人参皂苷标准储备溶液，用甲醇逐级稀释成质量浓度为30μg·mL-1、10μg·mL-1、5μg·mL-1、1μg·mL-1、0.5μg·mL-1、0.1μg·mL-1的混合标准工作溶液。

1.3实验条件

1.3.1供试溶液的制备

称取红参浸膏1g(精确至0.0001g),依次加入15mL水和35mL甲醇，超声30min,取出放至室温后转入50mL容量瓶，70%甲醇定容；5000rpm离心10min,取上清液过0.45μm微孔滤膜[1],再用70%甲醇稀释10倍作为供试溶液。

1.3.2色谱条件[8]

色谱柱：Shim-pack Velox C18(2.1mm×100mm, 1.8μm);流动相：A相为0.01%甲酸-水溶液；B相为0.01%甲酸-乙腈溶液；流速：0.4mL·min-1;柱温：45℃;进样量：1μL。梯度洗脱程序见表1。

表1液相色谱梯度洗脱程序

1.3.3质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI);电离模式：ESI-;检测方式：动态多反应监测(sMRM);离子化电压为-4500V;离子源温度为500℃;喷雾气为50psi;辅助气为55psi;气帘气为25psi。20种人参皂苷定性、定量的离子和质谱分析参数参考值见表2。

表2 20种人参皂苷质谱分析参数

2、结果与分析

2.1线性关系考察

根据之前制定的实验方案，对20种人参皂苷进行分析。按照浓度从低到高的顺序，将空白基质标准工作液逐一注入分析仪器，收集每种人参皂苷在不同浓度下的色谱峰面积数据，以质量浓度为横坐标，对应的色谱峰面积为纵坐标，为每一种人参皂苷绘制标准曲线。以信噪比S/N≥3确定方法检出限，以信噪比S/N≥10确定方法定量限[9-11]。结果表明，人参皂苷的20种成分在0.1～30μg·mL-1的浓度范围内有优异的线性关系，所有相关系数r值均超过0.999。这些成分的线性方程、相关系数、线性范围、定量限和检出限等关键参数，见表3。数据充分证明了该方法在分析这些人参皂苷时具有良好的线性响应和灵敏度。

表3 20种人参皂苷的线性关系和线性方程

2.2重复性评估

选取甲公司生产的红参浸膏作为代表性样本，依照1.3所述的方法，准备6份平行的供试溶液。通过计算各个皂苷单体峰面积的相对标准偏差(RSD),评估了方法的重复性[12]。实验结果显示，所有RSD值均小于2.62%,表明方法重复性良好，可满足检测要求，详细数据见表4。

2.3稳定性评估

研究对象为20种人参皂苷，评估其在提取后于样品瓶中存放不同时长(0h、12h、24h)的稳定性[13]。选取甲公司的红参浸膏作为代表性样本，依照1.3所述方法制备待测溶液。分析结果显示，20种人参皂苷含量的相对标准偏差(RSD)均小于4.89%,表明在此实验条件下，样品具有良好的稳定性，能够满足日常检测需求。详细数据见表4。

2.4精密度评估

选用浓度为5μg·mL-1的20种人参皂苷混合标准溶液，依照1.3所述的方法，进行6次重复实验。分析结果显示，相对标准偏差(RSD)均小于3.10%,表明此分析方法具有良好的精密度。详细的数据结果见表4。

2.5回收率评估

通过比较添加标准物质后的测定结果与原始样品的测定值之差，计算出回收率[14,15]。本研究选择了甲公司的红参浸膏作为基质样品。向1g的样品中添加了20种人参皂苷混合标准溶液，浓度分别为0.15mg·mL-1、0.30mg·mL-1、0.45mg·mL-1,每个浓度水平进行2次重复实验，取其平均值。实验结果显示，平均回收率范围在87.12%～109.98%,表明该分析方法具有良好的准确度。详细的数据结果见表4。

表4方法学评估结果

2.6样品的测定

分别采购市面上销售的甲、乙、丙3家公司红参浸膏产品，依照1.3所述的方法进行分析和测定。利用2.1建立的20种人参皂苷定量工作曲线，计算各样品中的具体含量，每个样品进行3次重复测定，取平均值作为最终结果。详细数据见表5。UPLC-MS/MS的总离子流图见图1。

表5 3家公司红参浸膏中20种人参皂苷含量

图1高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)的总离子流色谱图(TIC)

3、讨论与结论

本研究建立了一种高效液相色谱与串联质谱联用的方法，用于同时检测红参浸膏中20种人参皂苷的含量。该方法具有高灵敏度和强选择性，能够快速分离并准确定量红参浸膏中20种人参皂苷化合物，其线性范围、精确度、回收率和稳定性均表现良好。通过用此方法，对3家不同公司生产的红参浸膏中20种人参皂苷的含量进行了比较。结果表明，B公司生产的红参浸膏中20种人参皂苷的总含量最高，而C公司产品的Rg3、Rg5、Rg6、Rh1和Rk1等稀有人参皂苷的含量高于其他产品。此分析方法为企业提供了可靠的科学依据，有助于优化红参浸膏的生产工艺，并支持新产品的开发。

参考文献:

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