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SRSF1调控RBBP6发生可变剪接事件对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响

2024-12-02 63 上传者：管理员

摘要：目的：探讨剪接因子SRSF1介导RBBP6发生可变剪接后，其不同剪接体对多发性骨髓瘤（MM）细胞增殖的影响。方法：通过RT-PCR检测SRSF1调控RBBP6不同剪接体m RNA的表达水平。利用GEO数据库分析RBBP6同源异构体（isoform） 1在浆细胞疾病进展中的变化，通过生存分析评价该基因在MM患者预后中的价值。在体外功能缺失和功能获得实验中，将对照si RNA、RBBP6 isoform 1 si RNA、空载体（EV）、OE-RBBP6 isoform 3转染至MM.1S细胞中，用实时荧光定量PCR检测RBBP6 isoform 1、RBBP6 isoform 3 m RNA表达水平，Western blot检测蛋白表达，CCK-8法检测细胞增殖。结果：敲除SRSF1增加了RBBP6 isoform 3的表达，降低了RBBP6 isoform 1的表达。其中，RBBP6 isoform 1与浆细胞疾病的进展密切相关，RBBP6 isoform 1高表达组MM患者预后较差。下调RBBP6 isoform 1的表达和过表达RBBP6 isoform 3均能降低MM细胞的增殖能力；并且下调RBBP6 isoform 1的表达后，MM细胞中p53蛋白水平明显增高（P<0.05）。结论：在MM中，剪接因子SRSF1可导致RBBP6发生可变剪接异常，其中RBBP6 isoform 1促进MM细胞增殖，RBBP6 isoform 3抑制MM细胞增殖，并且其机制可能与调控p53途径相关。

关键词：
RBBP6
剪接因子SRSF1
可变剪接
多发性骨髓瘤
骨髓微环境
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多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是一种以骨髓微环境中恶性浆细胞克隆性增殖，伴有单克隆免疫球蛋白分泌，最终导致器官或组织损伤的浆细胞恶性增殖性疾病[1]。我国多发性骨髓瘤患者逐年增加，虽然蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂、自体干细胞移植等治疗方法使患者预后得到很大改善，但目前该疾病仍无法治愈[2-3]。因此，探寻与多发性骨髓瘤相关的机制对于其治疗策略至关重要。

可变剪接是控制基因表达的关键节点，异常的选择性剪接会导致抑癌基因和癌基因的表达失衡，从而促进肿瘤生长[4]。研究发现，在肿瘤细胞中由于剪接位点和剪接调控元件的突变或剪接因子表达改变会出现异常的可变剪接[5]。有研究表明，在髓样肿瘤细胞中发现参与剪接过程的基因发生反复突变[6]，在肺癌和乳腺癌中也发现存在少量的剪接因子相关的突变基因[7]，因此，剪接过程变化可能是癌症发生的另一种标志。

SR蛋白在剪接过程的多个环节中起重要作用，并参与组成性剪接和选择性剪接[8]。SR蛋白可以与pre-m RNA直接结合，并以浓度依赖的方式引起选择性剪接的改变。因此，SR蛋白的改变能够在肿瘤中调节许多基因的可变剪接[9]。剪接因子SRSF1是一种典型的SR蛋白，除具有剪接功能外，还可以介导m RNA的衰变过程，并且在m RNA输出和翻译中发挥作用[10]。本课题组在先前的研究中发现SRSF1在骨髓瘤中调控着可变剪接事件的发生，可作为MM的治疗靶点和潜在的预后生物标志物[11]。但SRSF1在多发性骨髓中具体调控的可变剪接事件尚未明确。本研究旨在探讨SRSF1调控的具体可变剪接事件。据报道，RBBP6 isoform 1可能是致癌基因，而RBBP6 isoform 3与抗癌活性密切相关[12]。因此，本研究通过RBBP6不同剪接体的功能获得和功能缺失实验，研究RBBP6不同剪接体对MM细胞增殖的影响，为MM发病机制的研究提供参考。

1、材料和方法

试剂与仪器

RPMI 1640培养基、胎牛血清均购自美国Hy Clone公司，TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司，异丙醇、三氯甲烷、无水乙醇均购自国药集团，逆转录试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司，BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（6×）均购自上海碧云天生物技术有限公司，PVDF膜购自美国Millipore公司，SYBR Green Mix购自美国Promega公司，Anti-GAPDH antibody、Anti-p53 antibody均购自美国Proteintech公司，Anti-RBBP6购自英国Abcam公司，Anti-Rabbit荧光二抗、Anti-Mouse荧光二抗均购自美国Licor公司，引物购自苏州金唯智公司，si RNA、sh RNA购自苏州吉玛公司，CCK-8检测试剂盒购自日本同仁化学研究所。凝胶电泳系统、蛋白凝胶成像仪、荧光定量PCR仪均购自美国Bio-Rad公司，离心机、移液枪均购自德国Eppendorf公司，细胞培养箱购自中国香港Heal Force公司，低温冰箱、酶标仪、核酸检测仪、超净工作台购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

细胞培养及转染

本课题中所用的人多发性骨髓瘤细胞系MM.1S由本实验室保存并经过短串联重复序列基因分型鉴定。MM.1S细胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基在37℃、5%CO2的条件下培养。在六孔板中每孔接种5×104个细胞，培养至细胞密度为80%时，以198×g离心3 min收集细胞，PBS清洗细胞2次。使用90μl Buffer R重悬细胞，加入10μl目的基因si RNA、RBBP6 isoform 3过表达质粒，电穿优化实验发现骨髓瘤细胞MM.1S的最佳转染条件为1 400V、20 ms、2 pulse。将转染后的细胞置于37℃、5%CO2条件下培养，用于后续实验。si RNA序列见表1。

Table 1.The sequence of si RNAs

CCK-8法检测细胞增殖抑制率

取转染30 min后的细胞铺板于96孔板，分别于0h、24 h、48 h和72 h每孔加入10μl CCK-8,1.5-2h后用多功能酶标仪检测450 nm处的吸光度，每组3个复孔。按照以下公式计算细胞活力：细胞活力（%）=[(A干扰-A空白)/(A对照-A空白)]×100%。

逆转录PCR与实时荧光定量PCR检测基因表达

收集细胞后，用TRIzol提取RNA，核酸检测仪测定RNA浓度，按逆转录试剂盒体系1加样，PCR仪中65℃反应5 min，再加入试剂盒体系2的所有试剂后设置反应条件为：25℃5 min,42℃60 min,70℃5 min终止反应。实时荧光定量PCR体系加样比例为：模板c DNA 1μl，上游引物（10μmol/L)0.4μl，下游引物（10μmol/L)0.4μl,SYBR Green Mix(2×) 10μl，无核酶水8.2μl。PCR反应条件如下：95℃10 min,95℃30 s,60℃1 min，循环40次；72℃10 min。q PCR引物见表2。

Western blot检测蛋白表达

以198×g离心10 min，收集细胞，加入100μl 1×细胞裂解液，4℃裂解30 min后12 000×g、4℃离心15 min，将上清转移到新的1.5 ml EP管中，按比例加入6×Loading Buffer,100℃煮沸10 min。将20µl蛋白加入96孔板中，再在各孔中加入200µl BCA工作液，在37℃条件下孵育30 min。采用酶标仪检测562 nm处的吸光度，根据标准曲线和样品体积计算相应的蛋白浓度。使用SDS-PAGE Gel Fast Parparation Kit配制12%下层分离胶和5%上层浓缩胶，80 V电泳35 min以浓缩样品，110 V电泳45min以分离蛋白条带，随后75 V冰浴转膜75 min。PVDF膜用5%BSA封闭液室温孵育1 h，一抗室温孵育1h后4℃过夜，二抗于TBST中以1︰10 000稀释，避光孵育2 h，采用荧光成像仪显影。

统计学分析

所用基因表达芯片数据（GSE5900、GSE4581）来源于美国国家生物技术信息中心（NCBI）的GEO数据库。采用Graph Pad Prism 7.0统计软件进行数据分析。两组计量资料的比较采用t检验或两独立样本的秩和检验；多组计量资料的比较采用方差分析；两变量之间的关系采用Pearson相关性分析。所有检验均采用双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。本文中所有数据均由3次以上重复实验得到。

2、结果

敲除SRSF1对RBBP6可变剪接体的影响

在建立敲除剪接因子SRSF1的骨髓瘤细胞系MM.1S中，使用RT-PCR的方式，采用特异性的扩增引物检测骨髓瘤细胞MM.1S中的RBBP6同源异构体m RNA的表达水平。结果表明，敲除SRSF1增加了MM细胞中RBBP6 isoform 3的m RNA表达水平，降低了RBBP6 isoform 1和RBBP6 isoform 2的m RNA表达水平（图1）。

RBBP6 isoform 1在浆细胞疾病中的表达水平

RBBP6与多种癌症相关，为了探究RBBP6 isoform 1对MM的影响，使用GEO数据集（GSE5900）首先对RBBP6 isoform 1在浆细胞疾病进展中的表达情况进行分析。结果显示，RBBP6 isoform 1的表达量在健康人中较低，随着浆细胞疾病的进展，其表达量逐渐增高（图2）。

RBBP6 isoform 1表达与MM患者预后的关系

根据RBBP6 isoform 1相对表达量，将MM患者分为RBBP6 isoform 1高表达组与低表达组，通过Kaplan-Meier曲线分析两组患者的生存情况，结果显示，RBBP6 isoform 1高表达患者的生存时间显著低于RBBP6 isoform 1低表达患者（图3）。

RBBP6 isoform 1对MM细胞增殖的影响

为了探究RBBP6 isoform 1对MM细胞增殖的作用，本研究通过在MM细胞系MM.1S中转染RBBP6isoform 1的小干扰RNA，下调RBBP6 isoform 1 m RNA和蛋白的表达（图4A），通过CCK-8检测MM细胞的增殖情况。结果显示，转染RBBP6 isoform 1小干扰RNA的骨髓瘤细胞增殖能力明显下降（图4B），提示RBBP6 isoform 1促进了MM细胞增殖。

过表达RBBP6 isoform 3对MM细胞增殖的影响

为了探究RBBP6 isoform 3对MM细胞生物学活性的影响，在MM细胞中转染RBBP6 isoform 3过表达载体，上调RBBP6 isoform 3蛋白和m RNA的表达（图5A）。随后检测RBBP6 isoform 3对MM细胞增殖的影响，于0、24、48、72 h后检测并计算RBBP6 isoform 3过表达组和对照组的细胞增殖率。CCK-8检测结果显示，过表达RBBP6 isoform 3后MM细胞增殖能力显著下降（图5B）。

RBBP6 isoform 1影响MM细胞增殖可能与调控p53途径相关

为了探究RBBP6 isoform 1促进MM细胞增殖是否与p53相关，通过Western blot检测下调RBBP6 isoform 1后MM细胞中的p53蛋白表达水平，结果显示，下调RBBP6 isoform 1后，MM细胞中p53蛋白表达水平明显增高（P<0.05），提示RBBP6 isoform 1可能通过p53途径促进MM细胞增殖（图6，表3）。

3、讨论

多发性骨髓瘤是常见的血液系统恶性肿瘤，发病率在血液系统肿瘤中位居第二[13]。MM的发病机制复杂并且涉及分子细胞遗传学异常，肿瘤基因组学的研究促进了人们对多发性骨髓瘤发病机制的理解[14]。可变剪接在RNA和蛋白质水平上使基因产生了多样性，破坏了外显子和内含子的剪接调控基序，从而影响肿瘤相关基因的剪接，使其产生不同的转录本，发挥不同的功能[15]。本课题组先前的研究建立了敲除剪接因子SRSF1的骨髓瘤细胞系MM.1S，通过转录组测序探究SRSF1在骨髓瘤中调控的可变剪接事件，在测序结果中关注到了RBBP6[11]。视网膜母细胞瘤结合蛋白6(RBBP6）基因位于染色体16p12.2上，是一种250 k Da的剪接核蛋白，参与细胞周期和凋亡的调节。通过可变剪接，RBBP6编码3种蛋白同源异构体（isoform),isoform 3仅由DWNN（无名结构域）组成，isoform 1和2则由额外的CCHC锌指结构域、RING指状结构域、Rb结合域、p53结合域、富含脯氨酸的结构域和富含丝氨酸结构域组成[16-18]。视网膜母细胞瘤结合蛋白（RBBP family）是一类能结合视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein,Rb）的蛋白家族，RBBP6作为其中的一员，除了能结合Rb以外，还能结合p53。有报道指出，RBBP6在细胞周期、增殖、凋亡和化学抗性中起重要作用[19]。文献报道，RBBP6isoform 1在肿瘤细胞中高表达，其通过抑制肿瘤细胞凋亡从而促进肿瘤细胞增殖[12]。也有文献指出，RBBP6 isoform 1可通过E3泛素连接酶Mdm2介导p53的泛素化，通过促进p53的降解从而促进细胞增殖[12,20]。

本研究结果表明，SRSF1调控RBBP6发生可变剪接事件，SRSF1下调导致RBBP6 isoform 3表达增加，而RBBP6 isoform 1表达降低。RBBP6 isoform1的表达量随着浆细胞疾病的进展逐步增加，并且其表达量与MM患者的预后密切相关。进一步研究结果表明，过表达RBBP6 isoform 3和下调RBBP6isoform 1能够抑制骨髓瘤细胞的生长，并且RBBP6isoform 1下调后，骨髓瘤细胞中p53表达水平随之增高，表明RBBP6 isoform 1促进骨髓瘤细胞增殖可能与p53途径有关。

基金资助:国家自然科学基金项目(82270197,82270211);中核医疗核医科技创新计划资助项目(ZHYLYB2021002);苏州市基础研究计划(SKY2023010);

文章来源:张维敏,宋莎,庄文卓,等.SRSF1调控RBBP6发生可变剪接事件对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响[J].中国实验血液学杂志,2024,32(06):1738-1743.