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UPLC特征图谱结合黄酮类活性成分含量测定的沙棘配方颗粒质量研究

2025-01-27 87 上传者：管理员

摘要：目的：建立沙棘配方颗粒质量评价方法，整体评价不同产地沙棘配方颗粒产品质量的均一性及差异化。方法：采用UPLC法，色谱柱为Shim-pack GIST C18-AQ HP（150.0 mm×2.1 mm,1.9μm），流动相为乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脱，流速为0.3 mL/min，检测波长为260 nm，柱温为30℃，对不同产地沙棘配方颗粒进行相似度评价、聚类分析（CA）、主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），并采用相同UPLC色谱系统及方法同时测定多种黄酮类成分含量，对18批沙棘配方颗粒进行质量分析和评价。结果:沙棘配方颗粒特征图谱确定12个共有峰且全部指认，分别为峰1（5-羟基糠醛）、峰2（原儿茶酸）、峰3（槲皮素-3-O-槐二糖-7-O-鼠李糖苷）、峰4（异鼠李素-3-O-槐二糖-7-O-鼠李糖苷）、峰5（异鼠李素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷）、峰6（芦丁）、峰7（异槲皮苷）、峰8（水仙苷）、峰9（异鼠李素-3-O-葡萄糖苷）、峰10（田基黄苷）、峰11（槲皮素）、峰12（异鼠李素）。18批沙棘配方颗粒特征图谱与对照图谱相似度均大于0.90，聚类分析将全部样品分为2类，两个主成分的累积方差贡献率为92.433%，并筛选出3个影响质量的差异性成分；芦丁、异槲皮苷、水仙苷、田基黄苷、槲皮素、异鼠李素在各自质量浓度范围内线性关系良好；仪器精密度、方法重复性、溶液稳定性试验RSD值均<3%。结论：不同产地沙棘样品存在一定的质量差异。本研究建立的特征图谱及黄酮类指标成分含量测定方法可客观、全面、准确地对沙棘配方颗粒进行质量评价。

关键词：
UPLC法
干燥果实
沙棘配方颗粒
聚类分析
质量研究
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沙棘系蒙古族、藏族习用药材[1]，为葫芦科植物沙棘的干燥果实，成熟或冻硬时采收。沙棘可清肺止咳，助消化，多用于治疗心血管疾病[2]。沙棘广泛分布于我国新疆、内蒙古、陕西、青海等地，产量占世界沙棘产量99%以上[3]。沙棘在保护水土、改善生态环境等方面起着重要作用[4]。沙棘是一种药食同源的植物[5-6]，所含成分较丰富，主要包括黄酮类、多酚类、有机酸类、维生素、糖及微量元素[7-11]。其主要活性成分为黄酮类成分[8]。蒙药名著《蒙药正典》和藏药古籍《晶珠本草》中均记载了沙棘有清肺止咳、增强体阳、利心脏血脉、活血化瘀、助消化等功效[1，12]。现代药理研究表明，沙棘在护肝、降血糖、抗氧化、免疫调节等方面有较好的药理活性[7，13-14]。此外，在食品、保健品领域沙棘果也应用广泛，如制成沙棘糕、果汁、果酱、果肉油及一些相关保健品等[15]。因此，沙棘在食品保健及治疗多种疾病等方面均有较好的研究价值和应用前景。沙棘配方颗粒是由沙棘饮片经水提、分离、浓缩、干燥、制粒而成，也可称为免煎中药饮片。其质量监管已纳入中药饮片管理范畴。目前，有关沙棘配方颗粒质量评价相关研究较少，故本研究建立能同时反映沙棘配方颗粒中多类活性成分信息的UPLC特征图谱，通过对不同产地样品进行特征图谱相似度评价及化学模式识别研究，并同时测定其中多个黄酮类成分的含量，旨在为沙棘配方颗粒整体质量控制和评价提供参考。

1、材料

1.1主要仪器

ACQUITY Arc型超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；ME36S型电子天平（梅特勒公司）；UC-4000型超声波清洗器(深圳市朗杰超声电器有限公司)。

1.2试剂与药物

5-羟甲基糠醛（批号：111626-202316，纯度：98.4%，编号：DZ1）、原儿茶酸（批号：110809-202207，纯度：97.5%，编号：DZ2）、槲皮素-3-O-槐二糖-7-O-鼠李糖苷（批号：AY001245-202305，纯度：95.0%，编号：DZ3）均购自佛山奥羽生物科技有限公司；异鼠李素-3-O-槐二糖-7-O-鼠李糖苷（佛山奥羽生物科技有限公司，批号：AY145872-202305，纯度：98.0%，编号：DZ4）；异鼠李素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷（成都普思生物科技有限公司，批号：PU0198-005MG，纯度：98.0%，编号：DZ5）；芦丁（批号：100080-202012，纯度：91.6%，编号：DZ6）、异槲皮苷（批号：111809-202205，纯度：96.3%，编号：DZ7）、水仙苷（批号：111997-202302，纯度：93.1%，编号：DZ8）、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷对照品（批号：000441-202202，纯度：98.6%，编号：DZ9）均购自江西佰草源生物科技有限公司；田基黄苷对照品（佛山奥羽生物科技有限公司，批号：AY124570-202305，纯度：98.1%，编号：DZ10）；槲皮素酸对照品（批号：100081-201610，纯度：99.1%，编号：DZ11）、异鼠李素对照品（批号：110860-202012，纯度：99.1%，编号：DZ12）均购自中国食品药品检定研究院；沙棘对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121519-201302，编号：DZ13）；DZ1、DZ2、DZ6、DZ7、DZ8、DZ11、DZ12、DZ13标准品均购自中国食品药品检定研究院；甲醇（德国默克公司）为色谱纯；水为超纯水。

1.3样品信息

沙棘样品信息见表1。

表1 18批沙棘样品信息

2、方法与结果

2.1色谱条件

Shim-pack GIST C18-AQ HP（2.1 mm×150.0 mm，1.9μm）色谱柱，流动相为乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脱[0～5 min，V（A）∶V（B）为5%：95%，5～12 min，V（A）∶V（B）为5%：95%→15%：85%，12～25 min，V（A）∶V（B）为15%：85%→18%：82%，25～45 min，V（A）∶V（B）为18%：82%→45%：55%，45～50 min，V（A）∶V（B）为45%：55%]；检测波长为260 nm；进样量为2μL；柱温为30℃，流速为0.3 mL/min。

2.2对照品溶液的制备

分别精密称取DZ2、DZ6、DZ7、DZ8、DZ10、DZ11、DZ12等编号对照品适量，加50%乙醇制成每1 mL含40μg相应成分的混合溶液，滤过，作为对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备

取沙棘配方颗粒研细，精密称定约0.8 g，置具塞锥形瓶中，提取溶剂为50%乙醇，精密加入20 mL，称量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，冷却后再次称量，用提取溶剂补足损失的质量，摇匀，过滤，即得。

2.4特征图谱研究

2.4.1精密度试验

取样品P1按“2.3”项下方法制备1份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，结果同一供试品各特征峰相对保留时间RSD值均≤0.77%，相对峰面积RSD值均≤1.1%，说明仪器精密度良好。

2.4.2重复性试验

取样品P1按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样，结果平行6个样品各特征的相对保留时间RSD值均≤0.82%，相对峰面积RSD值均≤2.3%，说明方法的重复性良好。

2.4.3稳定性试验

取样品P1按“2.3”项下方法制备1份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别于0、4、8、16、24 h进样测定，结果各时间点各特征峰的相对保留时间RSD值均≤0.89%，相对峰面积RSD值均≤2.13%，说明供试品溶液在24 h内较稳定。

2.4.4特征图谱的构建及相似度评价

6个产地18批沙棘配方颗粒特征图谱色谱图、沙棘对照药材色谱图见图1～3。将数据导入“中药色谱特征图谱相似度评价系统”，计算不同产地沙棘配方颗粒特征图谱相似度，多批沙棘配方颗粒样品（编号：P1~P18）相似度为0.949~0.989，18批样品相似度均＞0.90，表明不同产地沙棘配方颗粒化学成分较为相似，产地因素对沙棘化学成分有一定影响。特征图谱共有12个共有特征峰，2号峰原儿茶酸响应最大，出峰时间适中，分离度良好，故将其设为参照峰（S）。计算各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积。（见表2～3）

图1 18批沙棘配方颗粒特征图谱共有模式注：

图2沙棘配方颗粒和对照品定位色谱图

信号/mV时间/min信号/mV时间/min632025年1月第31卷第1期January.2025 Vol.31 No.1表2不同产地沙棘配方颗粒特征图谱相似度结果

表3多批次沙棘样品特征峰相对保留时间

表4多批次沙棘样品特征峰相对峰面积

2.4.5聚类分析

对18批沙棘配方颗粒进行聚类分析，当欧氏距离为10时聚为3类，P13、P14聚为一类，P15、P16聚为一类，其余批次聚为一类。当欧氏距离为5时聚为5类，P1、P2、P3、P4、P17、P18聚为一类，说明该批次沙棘质量较为接近。P5、P6聚为一类，P7、P8、P9、P10、P11、P12聚为一类，P15、P16聚为一类，P13、P14聚为一类。说明5个产地不同批次沙棘的成分有一定的差异。（见图4）图4沙棘配方颗粒特征图谱共有峰聚类分析图

图3沙棘对照药材色谱图

2.4.6主成分分析

将12个特征峰峰面积导入SPSS 22.0软件，对不同产地样品进行主成分分析，主成分1、2的特征值均>1，累积方差贡献率为92.433%。（见表5）计算各样品中2个主成分得分F1、F2，并计算综合得分F（F=0.79118F1+0. 13315F2)，公式中系数分别为前2个主成分的方差贡献率。（见表6、图5）

表5沙棘主成分特征值及方差贡献率主成分

表6沙棘主成分得分及综合得分

图5沙棘配方颗粒UPLC特征图谱主成分得分图

2.4.7正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）

采用SIMCA13.0软件，以18批沙棘配方颗粒共有峰峰面积为变量进行OPLS-DA分析，结果见图6～7。模型参数表明所建模型的解释能力和预测能力均较好，18个样品可分成5类。以VIP值>1为提取标准，筛选得到峰2（原儿茶酸）、峰8（水仙苷）、峰4（异鼠李素-3-O-槐二糖-7-O-鼠李糖苷）是影响分类的主要标志性成分。该模型能有效地分析18批沙棘配方颗粒的特征图谱信息。

图6沙棘配方颗粒UPLC特征图谱OPLS-DA得分图

图7沙棘配方颗粒UPLC特征图谱VIP值

2.5含量测定结果

2.5.1含量测定方法学验证

根据“2.1”项下色谱条件建立沙棘中芦丁、异槲皮苷、水仙苷、田基黄苷、槲皮素、异鼠李素的含量测定方法。结果表明指标均符合2020年版《中华人民共和国药典》指导原则要求规定。（见表7）

表7沙棘配方颗粒含量测定方法学验证结果

2.5.2多批次沙棘黄酮类成分的含量

不同产地沙棘中芦丁的含量范围为0.042%~0.078%，异槲皮苷的含量范围为0.037%~0.072%，水仙苷的含量范围为0.22%~0.47%，田基黄苷的含量范围为0.21%~0.47%，槲皮素的含量范围为0.028%~0.085%，异鼠李素的含量范围为0.12%~0.40%（见表8）。OPLSDA筛选出水仙苷是影响分类的主要标志性成分之一。陕西榆林产地多批次沙棘配方颗粒水仙苷含量范围为0.44% ~0.47%，整体较高，说明该产地沙棘质量较好。新疆阿勒泰产地的沙棘配方颗粒水仙苷含量多低于0.35%，整体偏低，说明该产地的沙棘质量较偏低。水仙苷含量测定结果表明，不同产地含量高低分布与沙棘配方颗粒UPLC特征图谱OPLS-DA得分图基本一致，且与聚类分析的结果有一定的关联。而不同批次同一产地沙棘中多种黄酮类成分的含量也有一定差异，可能与产地环境、采收时间、采收方式、加工方式等因素有关。成分回归方程r线性范围（/μg/mL）加样回收率%652025年1月第31卷第1期January.2025 Vol.31 No.1

表8沙棘配方颗粒中芦丁、异槲皮苷、水仙苷、田基黄苷、槲皮素、异鼠李素含量测定结果

3、讨论

中药配方颗粒为对中药汤剂剂型改造的适应性产品之一，是传统中药饮片具有创新性的应用形式[16]。目前相关沙棘配方颗粒特征图谱文献研究较少，主要是对沙棘黄酮类活性成分及化学成分的研究。本研究经优化确定色谱条件、色谱柱、检测波长、提取溶剂等，建立了沙棘配方颗粒特征图谱及含量测定色谱方法。

本试验确定了沙棘配方颗粒12个特征共有峰，包含酚类、黄酮类等多种成分且全部指认。定量检测方法仪器精密度、方法重复性、溶液稳定性、线性关系、加样回收率等指标均符合指导原则要求[17]。该沙棘配方颗粒质量评价系统简易、稳定、全面。为进一步分析不同产地沙棘配方颗粒的质量，本研究通过聚类分析对特征图谱数据进行分析。结果表明产品批次间质量稳定性较好，不同产地沙棘配方颗粒存在一定的质量差异。主成分分析（PCA）得出两个主成分的累积方差贡献率为92.433%。OPLS-DA将18批样品分为5类，与5个不同产地收集的样品相符合。本研究基于VIP值进一步筛选出大于1的差异性成分3个。多批次含量结果表明，陕西榆林市沙棘样品整体含量较高，新疆阿勒泰产地的沙棘样品整体含量偏低，客观反映了产地质量优劣情况。这也与聚类分析及OPLS-DA结果基本一致。综上所述，本研究从黄酮类活性成分出发，建立专属性的含量测定及特征图谱相结合的检测方法，综合评价了不同产地沙棘配方颗粒的质量差异，并结合相似度评价及化学模式识别研究相关分析，综合客观评价了其质量。不同产地沙棘样品存在一定的质量差异。本研究建立的特征图谱及黄酮类指标成分含量测定方法可客观、全面、准确地对沙棘配方颗粒进行质量评价，从而为整体控制沙棘配方颗粒的质量提供依据。

参考文献:

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基金资助:深圳市科技计划项目(JSGG20191129093418578);

文章来源:蔡小兵,江斌,谭沛.UPLC特征图谱结合黄酮类活性成分含量测定的沙棘配方颗粒质量研究[J].中医药导报,2025,31(01):61-66.