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藏药五味甘露药浴汤散指纹图谱及指标成分含量测定研究

2025-01-27 55 上传者：管理员

摘要：目的：建立藏药五味甘露药浴汤散高效液相色谱（HPLC）法指纹图谱，并测定黄酮指标成分金丝桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素和穗花杉双黄酮的含量。方法：采用Ultimate XB-C18（250.0 mm×4.6 mm,5.0μm）色谱柱；流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液；梯度洗脱；流速为1 mL/min；检测波长为360 nm；柱温为30℃；进样量为10μL。结果：五味甘露药浴汤散HPLC指纹图谱共标识出16个共有峰，指纹图谱相似度>0.99。黄酮指标成分金丝桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、穗花杉双黄酮分别在4.91～98.10μg/mL（r=1.000 0）、4.93～98.60μg/mL（r=0.999 6）、4.99～99.92μg/mL（r=1.000 0）、2.50～49.80μg/mL（r=0.999 9）、2.48～49.50μg/mL（r=0.999 8）范围内线性关系良好，平均加样回收率（n=6）分别为98.0%（RSD=0.52%）、96.3%（RSD=1.79%）、100.2%（RSD=0.54%）、100.4%（RSD=0.70%）、99.6%（RSD=0.80%）。结论：建立的指纹图谱及多成分含量测定方法专属性强、精密度高、稳定性好，可为提升五味甘露药浴汤散的质量标准提供依据。

关键词：
HPLC
五味甘露药浴汤散
指纹图谱
藏药
质量评价
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中国“藏医药浴法”于2018年被列入联合国教科文组织人类非物质文化遗产代表作名录，而藏药五味甘露药浴汤散是藏药浴的经典方剂。其处方源自《四部医典》，由刺柏、烈香杜鹃、麻黄、水柏枝、大籽蒿5味药材粉碎成粗粉后与青稞煎煮，加入酵母经发酵制备而成[1]。该药具有止痛活络、发汗消炎的功效，临床主要用于治疗风湿性关节炎[2]、面瘫[3]、骨关节炎[4]、皮肤病[5]、痛风、心脑血管疾病等[6]。本课题组研究发现本药浴预防和治疗急慢性肠胃炎、放射性肠损伤具有显著的药效作用，临床应用价值较大。五味甘露药浴汤散在现行的国家药品标准[WS-1000（Z263）-2006（Z）]中仅有盐酸麻黄碱、刺柏、烈香杜鹃的薄层鉴别，无含量测定项。目前关于本方的研究主要集中于药理药效及临床研究[7]，而质量研究方面鲜有报道。个别研究报道了盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱等单指标成分的含量测定[8-9]，未有多指标成分的研究。本方药效作用的发挥依赖于多指标成分的协同作用。五味甘露药浴汤散治疗痛风性关节炎的主要活性成分为木犀草苷、槲皮素、木犀草素等多种黄酮类成分[10]。因此，本研究采用HPLC法建立五味甘露药浴汤散的指纹图谱，并同时测定其中金丝桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、穗花杉双黄酮等5种黄酮指标成分的含量，旨在为建立五味甘露药浴汤散的质量标准提供参照依据。

1、材料

1.1主要仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；XSR205DU型十万分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）；UC-250DE型超声波清洗器、DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱均购自上海精其仪器有限公司。

1.2药物与试剂

五味甘露药浴汤散由西藏神猴药业有限责任公司提供（藏药制备字Z20210291000，批号：20231001，20231002，20231101，20231202，20240201，20240202）；金丝桃苷对照品（批号：DST230905-023，纯度98.3%）、木犀草苷对照品（批号：DSTDM001602，纯度98.7%）、槲皮苷对照品（批号：DST230310-006，纯度98.2%）、穗花杉双黄酮对照品（批号：DSTDS004601，纯度99.0%)均购自成都乐美天医药科技有限公司；槲皮素对照品（批号：10081-201610，纯度99.8%）购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

2、方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1供试品溶液的制备

取五味甘露药浴汤散，粉碎成细粉，精密称取细粉2.0 g，置于100 mL容量具塞锥形瓶中，加入80%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率为250 W，频率为40 kHz）1 h，放冷后再次称定质量，用80%甲醇补足减失质量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.1.2对照品溶液的制备

分别精密称定金丝桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、穗花杉双黄酮对照品9.98、9.99、8.14、9.98、10.00 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，制成金丝桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、穗花杉双黄酮质量浓度分别为981.00、986.00、799.30、996.00、990.00μg/mL的对照品储备液。分别精密吸取金丝桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、穗花杉双黄酮对照品储备液4、4、5、2、2 mL置于同一20 mL容量瓶中，加甲醇稀释定容，摇匀，制成含金丝桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、穗花杉双黄酮质量浓度分别为196.21、197.20、199.84、99.60、99.00μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.3空白溶液的制备

不加五味甘露药浴汤散，其余操作同“2.1.1”项下供试品溶液制备方法，制得空白溶液。

2.2色谱条件

色谱柱为Ultimate XB-C18（250.0 mm×4.6 mm，5.0μm）；流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液，梯度洗脱（见表1），检测波长为360 nm；柱温为30℃；进样量为10μL。

表1梯度洗脱时间表时间

2.3指纹图谱

2.3.1精密度试验

取五味甘露药浴汤散（批号：20231001），按“2.1.1”项下方法制备1份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续测定6次，以12号峰（槲皮素）为参照峰。16个共有峰的相对保留时间RSD值（n=6）均小于0.47%，相对峰面积的RSD值（n=6）均小于0.31%，表明仪器精密度良好。

2.3.2重复性试验

取五味甘露药浴汤散（批号：20231001），按“2.1.1”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，以12号峰（槲皮素）为参照峰。16个共有峰的相对峰面积的RSD值（n=6）均小于1.40%，表明该方法重复性良好。

2.3.3稳定性试验

取五味甘露药浴汤散（批号：20231001），按“2.1.1”项下方法制备1份供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h测定，以12号峰（槲皮素）为参照峰。16个共有峰的相对保留时间的RSD值（n=6）均小于0.38%，相对峰面积的RSD值（n=6）均小于1.17%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.4指纹图谱的建立

取6批五味甘露药浴汤散，分别按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液（S1-S6），按“2.2”项下色谱条件测定，将得到的色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，采用多点校正后进行色谱峰匹配，用平均数法生成6批五味甘露药浴汤散指纹图谱和对照指纹图谱R，共标识出16个共有峰。（见图1）将供试品溶液图谱（S1）与混合对照品溶液图谱（S0）进行对比，共指认出5个共有峰，即7号峰（金丝桃苷）、8号峰（木犀草苷）、9号峰（槲皮苷）、12号峰（槲皮素）、14号峰（穗花杉双黄酮）。（见图2）

图1 6批五味甘露药浴汤散粉末HPLC叠加图谱

图2共有峰的指认图

2.3.5指纹图谱相似度评价

使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”对6批五味甘露药浴汤散指纹图谱与对照图谱R的相似度进行分析。结果显示，6批五味甘露药浴汤散指纹图谱的相似度均大于0.99，表明各批次的五味甘露药浴汤散有较好的一致性，整体质量较稳定。（见表2）

表2指纹图谱相似度评价结果

2.4含量测定

2.4.1系统适用性及专属性试验

取“2.1”项下各溶液，分别进样，色谱图见图3。结果显示供试品与对照品溶液中各组分的色谱保留时间一致，空白无干扰，表明专属性较好。5个黄酮指标成分的色谱峰分离度、拖尾因子、理论塔板数均符合HPLC含量测定要求。

图3空白溶液（A）、供试品溶液（B）、对照品溶液（C）的HPLC图

2.4.2线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液0.5、0.5、1.0、2.5、2.5 mL置于20、10、10、10、5 mL的容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，分别测定，以质量浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线回归分析。（见表3）

表3 5种黄酮指标成分的回归方程、r和线性范围

2.4.3精密度试验

取“2.1”项下供试品溶液，连续重复进样6次，测得金丝桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、穗花杉双黄酮峰面积的RSD值（n=6）分别为0.26%、0.40%、0.31%、0.23%、0.18%，表明仪器的精密度良好。

2.4.4稳定性试验

取五味甘露药浴汤散，按照“2.1.1”项下方法重新制备1份供试品溶液，在同一室温下，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，测得金丝桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、穗花杉双黄酮峰面积的RSD值（n=6）分别为0.73%、0.23%、0.56%、0.27%、0.52%，表明溶液在室温下24 h内稳定。

2.4.5重复性试验

取同一批五味甘露药浴汤散（批号：20231001），按照“2.1.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，测得金丝桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、穗花杉双黄酮的平均含量分别为0.235 1、0.267 5、0.397 4、0.117 1、0.079 1 mg/g，RSD值（n=6）分别为0.49%、0.42%、0.12%、0.51%、0.42%，表明该方法重复性良好。

2.4.6加样回收率试验

精密称取已知含量的五味甘露药浴汤散（批号：20231001）9份，每份2 g，分成高、中、低剂量组，按照药物中各指标成分含有量的120%、100%、80%分别精密加入对照品溶液，再按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，测定并计算得金丝桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、穗花杉双黄酮的平均加样回收率分别为98.0%、96.3%、100.2%、100.4%、99.6%，RSD值（n=6）分别为0.52%、1.79%、0.54%、0.70%、0.80%。

2.4.7样品含量测定

取6批五味甘露药浴汤散，每批样品平行取样2份，分别按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，分别测定并计算各待测组分含量。6批样品中5种成分平均含量的RSD值均小于1.5%，说明黄酮类成分在制备过程中受制备工艺因素的影响较小，各批次样品的质量稳定性较好。（见表4）

表4 6批样品含量测定结果

3、讨论

3.1黄酮指标成分的选择

五味甘露药浴汤散的成分复杂。有研究采用网络药理学与分子对接探讨了五味甘露药浴汤散治疗关节炎的作用机制，研究了方中550个化学成分与1 365个潜在的作用靶点。结果表明化学成分与关键的作用靶点具有较好的结合活性。本方的作用发挥依赖多类成分，而黄酮类成分是主要的活性成分之一[10-11]。黄酮类成分是药材综合利用及有效部位新药研究的热点[12]。该类物质在植物体中通常与糖结合成苷类，小部分以游离态（苷元）的形式存在。黄酮苷元的种类丰富，可分为黄酮、黄酮醇、异黄酮、二氢异黄酮、黄烷酮、二氢黄酮醇、查尔酮等。研究表明，五味甘露药浴汤散中的各味药含有金丝桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、穗花杉双黄酮等多种黄酮指标成分[13-17]。这些黄酮指标成分具有抗炎、抗氧化、抗菌、治疗痛风性关节炎等作用[18-21]，因此，本研究根据现有网络药理学及分子对接对主要黄酮活性成分的研究成果，选择金丝桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素和穗花杉双黄酮作为黄酮指标成分。

3.2供试品溶液的制备

本研究采用单因素实验考察了不同产品粒径、提取溶剂、液料比、提取方式、提取时间对供试品溶液中黄酮类成分含量的影响[22]。结果表明，在相同提取条件下，采用细粉制备的供试品溶液中黄酮类成分含量显著高于粗粉，而细粉与极细粉差异并不显著。其原因为降低粒径有利于黄酮类成分的溶出。甲醇提取效率优于碱水、乙醇、乙酸乙酯、乙醚。在甲醇体积分数为20%~80%以及液料比为（5.00~12.5）∶1.00范围内，甲醇体积分数、液料比与供试品溶液中黄酮类成分含量呈正相关。甲醇体积分数超过80%以及料液比超过12.5∶1.0时，供试品溶液中黄酮类成分含量变化不显著，其原因与黄酮类成分的溶解性有关。超声和回流提取制备的供试品溶液中黄酮类成分差异不显著，并且超声时间在10~60 min范围内与供试品溶液中黄酮类成分含量呈正相关，而超声时间超过60 min，供试品溶液中黄酮类成分含量变化不显著。因此，本研究优选的供试品溶液制备方法为样品粉碎成细粉，按液料比12.5∶1.0加入80%甲醇，超声提取60 min。

3.3流动相和波长的选择

本研究参照五味甘露药浴汤散中单味药材黄酮类成分测定方法[17，23]，比较了甲醇-水、甲醇磷酸水、乙腈-水、乙腈-磷酸水作为流动相。结果表明，乙腈0.4%磷酸水梯度洗脱时指标成分的分离度、峰形、响应值较好。金丝桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、穗花杉双黄酮5种成分在270~360 nm范围的波长中可被检出，但在不同的检测波长下5种成分的相对色谱峰面积有较大变化。综合各指标成分的最大吸收波长及混合对照品溶液在各检测波长的吸收峰面积，各成分在360 nm波长均有较高的吸收峰面积。因此，本研究选择乙腈-0.4%磷酸水为流动相，梯度洗脱，检测波长360 nm。

4、结论

本研究采用HPLC法建立五味甘露药浴汤散的指纹图谱，并测定黄酮指标成分金丝桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素和穗花杉双黄酮含量测定方法。该方法准确性、稳定性较高，操作简便，可为建立五味甘露药浴汤散的质量标准提供参照依据。6批次五味甘露药浴汤散的指纹图谱及黄酮类成分含量指标评价结果证实产品的质量稳定性较好，但也提示为确保黄酮类成分的溶出，应降低产品的粒径。

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基金资助:国家自然科学基金项目(82304595);西藏自治区科技厅区域科技协同创新专项(QYXTZX-RKZ2022-07);

文章来源:杨俊峰,吴浩震,吴明慧,等.藏药五味甘露药浴汤散指纹图谱及指标成分含量测定研究[J].中医药导报,2025,31(01):67-70+76.