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METTL5、VIRMA在肝细胞肝癌中的表达及与临床预后的关系

2025-05-20 73 上传者：管理员

摘要：目的研究肝细胞肝癌（HCC）中甲基转移酶样蛋白5（METTL5）、病毒样m6A甲基转化酶（VIRMA）的表达及与临床预后的关系。方法选取2018年3月至2021年3月就诊于该院的89例HCC患者。应用免疫组化和荧光定量PCR检测组织METTL5、VIRMA蛋白和mRNA表达。利用Kaplan-Meier曲线和Cox回归分析METTL5、VIRMA蛋白对HCC预后的影响。结果HCC癌组织METTL5mRNA（3.23±0.55vs.0.61±0.20）,VIRMAmRNA（2.97±0.42vs.0.58±0.17）高于癌旁组织,差异有统计学意义（t=42.234、49.762,均P<0.001）。METTL5、VIRMA蛋白位于细胞质和细胞膜,部分位于细胞核。HCC癌组织METTL5[71.91%（64/89）vs.5.62%（5/89）]、VIRMA[69.66%（62/89）vs.6.74%（6/89）]阳性率高于癌旁组织,差异有统计学意义（χ2=82.385、74.627,P<0.001,P=0.001）。HCC中METTL5、VIRMA蛋白表达与肝癌分期标准（CNLC）、肿瘤最大径及血管侵犯有关,CNLC分期Ⅱ～Ⅲ期、肿瘤最大径≥5cm及血管侵犯的HCC癌组织中METTL5、VIRMA蛋白阳性率较高（均P<0.05）。METTL5阳性组和阴性组3年生存率为34.88%（15/43）,67.39%（31/46）,差异有统计学意义（Log-rankχ2=7.893,P=0.005）。VIRMA阳性组和阴性组3年生存率为36.36%（16/44）、66.67%（30/45）,差异有统计学意义（Log-rankχ2=9.828,P=0.002）。CNLC分期Ⅱ～Ⅲ期、肿瘤最大径≥5cm、血管侵犯、METTL5阳性、VIRMA阳性是影响HCC患者不良预后的危险因素。结论HCC中METTL5、VIRMA表达上调,均与CNLC分期Ⅱ～Ⅲ期、肿瘤最大径及血管侵犯有关,是评估HCC预后的肿瘤标志物。

关键词：
化疗
恶性肿瘤
甲基转移酶样蛋白5
病毒样m6A甲基转化酶
肝细胞肝癌
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肝细胞肝癌(HCC)是全球第五大常见恶性肿瘤,全球每年新发84.1万例[1]。HCC的病因和机制复杂,其具体的分子机制尚不清楚。目前HCC以手术、化疗及靶向等治疗方式为主,但术后肿瘤容易复发进展,总体疗效不佳[2]。寻找肝癌潜在的治疗和预后标志物,具有重要的临床意义。甲基转移酶样蛋白5(METTL5)具有S-腺苷-L-甲硫氨酸结合活性和N6-甲基转移酶活性,参与rRNA的甲基化修饰及蛋白表达调控,与遗传性智力发育障碍等疾病有关[3]。研究表明,胃癌中METTL5表达显著上调,促进癌细胞的鞘磷脂代谢,诱导癌细胞的增殖、迁移和侵袭,是新的肿瘤治疗靶点[4]。病毒样m6A甲基转化酶(VIRMA)又称为KIAA1429,位于细胞质溶胶和细胞核斑点中,与RNA结合形成N6-甲基腺苷(m6A)甲基转移酶复合物,参与mRNA的腺苷酸化修饰和甲基化修饰[5]。研究表明,乳腺癌中VIRMA表达上调,其能与胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3结合,促进透明质酸合成酶2mRNA的m6A修饰,促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭[6]。目前HCC中METTL5、VIRMA的表达及两者在HCC预后评估中的意义尚不明确。本研究旨在分析METTL5、VIRMA表达在评估HCC预后中的价值。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取2018年3月至2021年3月就诊于该院的89例HCC患者,其中男47例、女42例;年龄30~78岁,平均(62.17±6.15)岁;采用中国肝癌分期(CNLC)标准[7]分期:Ⅰ期37例,Ⅱ~Ⅲ期52例;采用Edmondson-Steiner分级系统进行病理分级[8]:Ⅰ~Ⅱ级49例,Ⅲ~Ⅳ级40例;肿瘤最大径:<5cm51例,≥5cm38例;术前甲胎蛋白(AFP):≤400μg/L50例,>400μg/L39例;乙型肝炎表面抗原阳性44例;血管侵犯31例。纳入标准:(1)均接受根治性手术治疗,病理诊断为原发性HCC;(2)均为首次就诊;(3)病理资料及临床资料完整。排除标准:(1)患者不能按要求进行随访;(2)合并严重的肝功能障碍、心功能不全等;(3)肿瘤已出现肝外器官的远处转移;(4)肝内胆管癌等其他病理类型的肝癌;(5)病理切缘阳性;(6)术后因手术并发症死亡。所有患者和家属签署知情同意书,本研究通过医院伦理检查。

1.2方法

1.2.1METTL5、VIRMA蛋白检测

取癌和癌旁组织(距离癌组织边缘2cm以上),10%中性甲醛固定12h,乙醇脱水及石蜡包埋后,4μm切片,按照常规免疫组化法进行染色,由1名专业病理科医师进行操作。METTL5、VIRMA一抗稀释比均为1∶100(美国CST公司,货号#48699、#88358)。利用日本奥林巴斯DX31型显微镜观察染色,染色强度评分:0分无染色,1分浅黄色,2分棕黄色,3分棕褐色;染色面积评分:0分<5%,1分5%~25%,2分>25%~50%,3分>50%~100%。两评分乘积小于2为阴性,≥2为阳性。

1.2.2METTL5mRNA、VIRMAmRNA检测

将组织利用组织研磨器研磨,Trizol法提取组织RNA,反转录为cDNA后,采用实时荧光定量PCR仪(美国赛默飞公司,ABI7500型)检测METTL5mRNA、VIRMAmRNA表达。引物由深圳华大基因公司合成,序列:METTL5上游5'-AAGGAACTAGAGAGTCGCCTG3',下游5'-GCGGCCTGGTAGGATACTG-3';VIRMA上游5'-TTGTCTCCAACCTTCCGTAGT-3',下游5'-CCAGATCAGAGAGGTGGTGTAG-3';GAPDH上游5'-CATTGCCCACTGATGCTGTG-3',下游5'-AGGCTTTCTACCCCATCTTGA-3'。体系:SYBRGreenPremix10μL,上游和下游引物(10μmol/L)各0.8μL,cDNA1μL,RNaseFree水7.4μL,终体积为20μL。程序:95℃5min,95℃30s,60℃30s,40个循环。METTL5mRNA、VIRMAmRNA结果用2-ΔΔCt表示。

1.3随访

患者自术后起每3~6个月进行门诊随访,对HCC患者进行全面的检查和评估。随访结束时间为2024年4月。随访终点为患者出现因HCC进展导致的死亡或随访结束。

1.4统计学处理

采用SPSS26.0统计学软件进行数据分析。计量资料采用x±s表示,组间用t检验比较。计数资料采用百分率表示,组间用χ2检验比较。采用Kaplan-Meier曲线分析不同METTL5、VIRMA表达对HCC预后的影响。Cox回归分析HCC预后影响因素。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1HCC中METTL5、VIRMAmRNA表达

HCC癌组织METTL5、VIRMAmRNA的相对表达量分别为3.23±0.55和2.97±0.42,分别高于癌旁组织METTL5、VIRMAmRNA的相对表达量(0.61±0.20和0.58±0.17),差异有统计学意义(t=42.234、49.762,均P<0.001)。见图1。

图1HCC中METTL5、VIRMAmRNA表达

2.2HCC中METTL5、VIRMA蛋白表达

METTL5、VIRMA蛋白棕黄色阳性染色主要定位于细胞质和细胞膜,部分位于细胞核。HCC癌组织METTL5、VIRMA蛋白阳性率分别为71.91%(64/89)、69.66%(62/89),高于癌旁组织METTL5、VIRMA蛋白阳性率5.62%(5/89)、6.74%(6/89),差异有统计学意义(χ2=82.385、74.627,均P<0.001)。见图2。

2.3不同临床病理特征HCC癌组织METTL5、VIRMA蛋白表达差异

HCC癌组织中METTL5、VIRMA蛋白表达与CNLC分期、肿瘤最大径及血管侵犯有关,CNLC分期Ⅱ~Ⅲ期、肿瘤最大径≥5cm及血管侵犯的HCC癌组织中METTL5、VIRMA蛋白表达阳性率高于CNLC分期Ⅰ期、肿瘤最大径<5cm及无血管侵犯的HCC癌组织,差异有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

2.4METTL5、VIRMA蛋白表达与HCC患者预后的关系

本组死亡43例,3年生存率为51.69%(46/89)。METTL5阳性组和阴性组3年生存率为34.88%(15/43)、67.39%(31/46),差异有统计学意义(Log-rankχ2=7.893,P=0.005)。VIRMA阳性组和阴性组3年生存率为36.36%(16/44)、66.67%(30/45),差异有统计学意义(Logrankχ2=9.828,P=0.002)。见图3。

图2HCC癌与癌旁组织METTL5、VIRMA蛋白表达

2.5Cox回归分析影响

HCC预后的因素以HCC患者随访中是否死亡为因变量(1=死亡,0=存活),将表1中P<0.05的因素为自变量,多因素Cox回归分析结果,CNLC分期Ⅱ~Ⅲ期、肿瘤最大径≥5cm、血管侵犯、METTL5阳性、VIRMA阳性是影响HCC患者不良预后的危险因素。见表2。

表1HCC中METTL5、VIRMA蛋白表达与临床病理特征的关系

图3HCC中METTL5、VIRMA蛋白表达与预后的关系

表2多因素Cox比例风险模型

3、讨论

我国是乙型肝炎病毒感染的高发国家,HCC患者例数占全球总数的一半以上,严重影响患者生命健康[9]。目前肝癌的治疗手段主要包括肝肿瘤切除、肝动脉插管化疗栓塞术、肝动脉灌注化疗等,特别是近年来肝癌疾病的诊断和治疗水平的提高,肝癌切除率有了显著的提升,但临床实践发现,HCC切除术后复发率依旧呈现上升趋势,患者术后恢复及生存预后较差[10]。探索影响HCC患者术后预后的相关因素,寻找能够预测肝癌术后预后的临床生物标志物,具有重要意义。

METTL5是m6A家族调控因子之一,参与18SrRNA的甲基化修饰,参与神经发育和干细胞分化过程的调节。研究表明,肝内胆管癌中METTL5表达上调,其能促进核糖体合成,上调转化生长因子-β的表达,促进癌细胞的侵袭和转移,导致肿瘤进展[11]。本研究中,HCC中METTL5表达升高。METTL5的表达受基因水平和蛋白水平的双重调控。既往有学者报道,METTL5基因的rs3769768位点的遗传多态性能够上调METTL5的表达,增加卵巢癌的发生风险,可能是肿瘤分子治疗的潜在靶点[12]。另外,肿瘤中tRNA甲基转移酶激活子亚基的表达升高还能够直接结合METTL5形成异二聚体复合物,增加METTL5蛋白的稳定性,维持细胞代谢稳定,促进癌细胞的增殖[13]。本研究中,HCC中METTL5表达与临床病理特征有关。分析其机制,HCC中METTL5的表达能够促进泛素特异性肽酶5的翻译,降低cMyc蛋白K48位点的泛素化修饰水平,增加c-Myc的稳定性,激活c-Myc下游糖酵解基因乳酸脱氢酶A、烯醇化酶1和丙酮酸激酶M2的表达,促进癌细胞的过度增殖[14]。此外,HCC中METTL5的过表达还能促进肿瘤微环境中白细胞介素6等免疫抑制因子的表达,抑制抗肿瘤CD8+T细胞的免疫浸润,增加肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关中性粒细胞的浸润,同时促进中性粒细胞胞外网状陷阱的产生和释放,诱导肿瘤免疫逃逸,促进肿瘤恶性进展[15-16]。本研究中,METTL5阳性HCC患者随访中死亡风险较高,提示METTL5的表达上调可能通过促进肿瘤进展,导致患者不良预后。分析其原因,METTL5的表达上调能够促进热休克转录因子4b的翻译,促进热休克蛋白90B1与突变型p53蛋白结合,抑制突变型p53蛋白的泛素化降解,促进鼻咽癌的肿瘤发生,增强癌细胞化疗耐药性的形成,导致患者不良预后[17]。

VIRMA相对分子质量约为202×103,其作为分子支架构成m6A甲基转移酶复合体,参与m6A的修饰过程,调控细胞生长及迁移。研究表明,乳腺癌中VIRMA的表达上调能够促进转录因子激活蛋白-2amRNA的m6A修饰及蛋白表达,抑制CD8+T淋巴细胞的浸润,促进癌细胞的免疫逃逸[18]。本研究中,HCC中VIRMA表达上调,其原因可能与HCC中VIRMA的转录后调控失调有关。研究表明,骨肉瘤中微小RNA-143-3p表达下调,引起其下游靶点VIRMAmRNA的稳定性增加,增强癌细胞的干细胞样特性,促进癌细胞的恶性增殖[19]。本研究中,VIRMA表达与HCC患者较差的临床病理特征相关。分析其原因,HCC中VIRMA的表达能够诱导抑癌基因GATA结合蛋白3mRNA前体的3'非翻译区的m6A甲基化修饰,破坏GATA结合蛋白3的mRNA前体与HuR蛋白的相互作用,促进GATA结合蛋白3降解,导致HCC的恶性进展[20]。此外,HCC中VIRMA的表达上调可降低m6A阅读器YTH结构域包含蛋白1mRNA稳定性,下调肿瘤抑制因子Rho家族GTP酶3的表达,促进HCC肿瘤的转移,是HCC的潜在预后生物标志物和治疗靶点[20]。本研究中,VIRMA阳性HCC患者随访中具有较高的死亡风险。分析其原因,VIRMA的表达能够增强癌细胞对化疗治疗的耐药性,降低术后辅助治疗疗效,导致患者不良生存预后。研究表明,VIRMA的表达上调能够明显增加顺铂化疗过程中癌细胞中磷酸化组蛋白H2AX的表达水平,促进DNA损伤修复反应,增强癌细胞对顺铂治疗的抵抗性,而敲除癌细胞中VIRMA的表达导致甲基转移酶复合物的破坏和m6A丰度的降低,癌细胞侵袭性能力降低,对顺铂治疗的敏感性增加[21]。

综上所述,HCC中METTL5、VIRMAmRNA和蛋白表达均显著上调,两者在CNLC分期Ⅱ~Ⅲ期、肿瘤最大径≥5cm及血管侵犯的HCC癌组织中表达升高更为明显,可能在HCC肿瘤的进展中均发挥促进作用。METTL5、VIRMA均是影响HCC患者死亡预后的危险因素,有利于指导临床预后评估。本研究也存在一些局限性,比如单中心、样本量少等,未来笔者拟设计前瞻性多中心的临床实验,进一步分析METTL5、VIRMA在评估HCC预后及指导临床治疗方案选择中的价值。

参考文献:

[7]中华人民共和国国家卫生健康委员会医政医管局.原发性肝癌诊疗指南(2022年版)[J].中华消化外科杂志,2022,21(2):143-168.

[10]王芳芳,张国范,王琪,等.HBV感染原发性肝癌患者GP73和AFU与25(OH)D3及其与TACE术后复发转移的关系[J].中华医院感染学杂志,2023,33(11):1660-1664.

基金资助:陕西省卫生健康科研基金项目(2019D0057);

文章来源:陈宏,刘磊,周华友,等.METTL5､VIRMA在肝细胞肝癌中的表达及与临床预后的关系[J].国际检验医学杂志,2025,46(09):1060-1065.