首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 医学毕业论文 > 医学本科毕业论文 > 心肌肥厚预适应的分子保护机制

心肌肥厚预适应的分子保护机制

2020-07-16 149 上传者：管理员

摘要：目的使用线粒体蛋白质谱分析方法，探讨心肌肥厚预适应的分子保护机制。方法14只雄性C57BL6/J小鼠随机分为假手术组(n=6)和心肌肥厚预适应组(n=8)，建立小鼠心肌肥厚预适应模型(主动脉弓缩窄3d、解除缩窄4d)，随机选假手术组3只、心肌肥厚预适应组4只小鼠做蛋白质组学分析，其余小鼠用于形态功能学实验。运用小鼠心脏超声及单个心肌细胞收缩检测技术检测心脏功能学变化，通过心脏常规病理切片及电子显微镜检测心肌组织形态学和线粒体超微结构变化，运用蛋白质组学技术及生物信息学方法，筛选出差异线粒体蛋白，并通过Westernblotting验证关键蛋白表达水平变化。结果心肌肥厚预适应组小鼠与假手术组小鼠相比，心脏功能及心肌组织形态学改变无显著性，但透射电子显微镜检测提示，线粒体嵴密度增加，后续利用线粒体蛋白质组学方法共筛选到20个差异表达蛋白(5个上调，15个下调);随后生物信息学分析显示，差异蛋白主要与线粒体核糖体蛋白有关;关键蛋白的Westernblotting验证结果与组学分析结果相一致。结论心肌肥厚预适应刺激能够增强心肌线粒体功能，这可能与线粒体核糖体蛋白介导的线粒体氧化磷酸化复合体的转录加工、运输过程相关。

关键词：
主动脉弓缩窄
心肌肥厚预适应
心肌能量代谢
线粒体核糖体
蛋白质组学
加入收藏

心肌肥厚是心脏为适应各种刺激而产生的心肌体积增大、重量增加[1]。心肌肥厚分为生理性心肌肥厚和病理性心肌肥厚两种类型。不同于病理性心肌肥厚，生理性心肌肥厚的心功能尚处于代偿阶段，心输出量能够维持正常甚至增加[2,3]。近年来，有研究显示，生理性肥厚刺激能够影响疾病的进程及预后[4,5]。Wei等[6]在2015年提出心肌肥厚预适应的概念，即短时间的生理性肥厚预刺激，能够使得心脏获得对后续的长时间肥厚刺激的抵抗能力，进而延缓心衰的进程。随后的基因组学研究发现，肥厚预刺激能够使心肌许多基因发生表达差异。其中关于Eya2基因的研究表明，肥厚预刺激带来的心肌保护作用可能与线粒体生物合成相关[7,8]。线粒体约占心肌细胞体积的1/3，且线粒体产生的三磷酸腺苷占总ATP的95%以上，这可能提示线粒体生物功能变化与心肌肥厚预适应有着密不可分的联系[9,10]。因此，我们通过建立心肌肥厚预适应模型，采用蛋白质组学的方法，研究心肌肥厚预适应对心肌细胞线粒体蛋白表达的影响，探讨心肌肥厚预适应的分子保护机制。

材料和方法

1．实验动物

雄性C57BL6/J小鼠由上海实验动物中心提供，实验动物合格证号:20170010000657。所有使用的方案均符合美国国立卫生研究院出版的“实验动物护理和使用指南”(第8版，NRC2011)，并经复旦大学中山医院伦理审查委员会批准(编号2015-196)。

2．实验分组及方案

心肌肥厚预适应模型的具体建立及鉴定方法详见我们团队先前的研究[11]，简要描述如下:8周龄C57BL6/J小鼠被随机分为两组，假手术组(sham组)3只和心肌肥厚预适应组(T3D4组)4只，第0天对T3D4组行主动脉缩窄术,sham组行假手术，3d后解除，7d后对两组小鼠进行心脏超声检查，之后对小鼠行安乐死，提取小鼠心肌细胞，检测心肌细胞收缩舒张功能;进行心肌组织病理学检查，透射电子显微镜下观察线粒体超微结构;提取心肌组织线粒体，进行线粒体蛋白质组学分析。

3．形态学检测

3.1透射电子显微镜样本处理:心肌组织电子显微镜切片制作及观察方法参考文献[12]。透射电子显微镜型号CM-120，荷兰飞利浦公司。

3.2HE染色:取小块心肌组织固定，用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡浸埋，切片，片厚5～6μm。常规HE染色。

3.3麦胚凝集素染色:石蜡切片脱蜡至水，入0.1%胰蛋白酶37℃避光反应25min，麦胚凝集素(染液37℃避光孵育2h,0.01mol/LPBS缓冲液冲洗5min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

3.4Masson染色:石蜡切片脱蜡至水，入Weigert铁苏木素溶液孵育6min后流水冲洗，盐酸乙醇分化，流水冲洗后入丽春红染色液孵育切片6min，流水冲洗后用磷钼酸水溶液孵育切片6min，接着入苯胺蓝溶液孵育切片6min，冰醋酸浸洗60s，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。Weigert铁苏木素溶液配制:100ml蒸馏水加入1ml盐酸与4ml30%三氯化铁溶液，与无水乙醇配制的1%苏木素等量混合。

4．成鼠原代心肌细胞收缩测试

将细胞爬片放置于倒置显微镜(OlympusⅨ-70)载物台上的小室中，并使用含有1mmol/L氯化钙的碳酸氢盐缓冲液进行循环。以0.5Hz电场刺激心肌细胞。

5．提取心肌组织线粒体

切取一小块心肌组织(约100mg)于1.5ml离心管，PBS清洗1次，剪碎组织，加入1ml预冷PBS，冰浴5min。600×g离心1min，弃上清液，加入800μl0.5%胰蛋白酶，冰浴20min。600×g离心1min，弃上清液。加入60μl线粒体分离试剂，匀浆40次后600×g离心5min。将上清转移入另一离心管，11000×g离心10min，沉淀即为分离得到的线粒体。

6．蛋白Trypsin酶解

蛋白质定量后取60μg蛋白溶液置于离心管中。加入5μl1mol/L二硫苏糖醇溶液混匀，37℃保温1h;加入20μl1mol/L吲哚乙酸溶液，混匀后，室温避光反应1h;吸取所有样品加入超滤管中，离心后弃收集液;加入100μl尿素缓冲液至超滤管中，离心后弃收集液，重复两次;加入50mmol/L碳酸氢铵100μl，离心后弃收集液，重复3次;更新收集管，在超滤管中加入0.25%胰蛋白酶，37℃酶解12h。

7．质谱分析

每份样品采用高效液相色谱系统进行分离，用缓冲液A(水，0.1%甲酸)和缓冲液B(乙腈，0.1%甲酸)洗涤柱。样品由自动进样器上样到质谱预柱，再经分析柱分离，样品分离后用质谱仪进行质谱分析。

8．生物信息分析

使用R语言数据分析软件(3.6.0)对差异表达蛋白(DEPs)进行基因本体注释以及京都基因与基因组百科全书通路富集分析。

9．免疫印迹法检测

提取线粒体蛋白后用10%聚丙烯酰胺凝胶进行凝胶电泳分离单白，然后300mA转膜2h将蛋白转移到PVDF膜上。5%牛血清清蛋白封闭30min，一抗4℃孵育过夜。加入二抗，室温孵育2h，用缓冲溶液洗涤3遍，显影。本实验使用的一抗是鼠抗基因损伤诱导蛋白相互作用蛋白1(GADD45Ginteractingprotein1,Gadd45gip1)单克隆抗体(1∶100,SantaCruse公司，sc-374122)，二抗是山羊抗小鼠IgG(1∶4000，上海威奥生物科技有限公司，WB0180)。

10．统计学分析

使用SPSS16.0统计学软件进行处理，数据以均值±标准误表示，使用t检验进行两组间比较。P<0.05时差异有统计学意义。

结果

1．各组小鼠的心脏功能及心肌细胞收缩变化

使用小动物心脏超声对两组小鼠心脏功能进行评估，与我们先前研究相一致[11],T3D4组与sham组小鼠相比，左室射血分数和左室短轴缩短率差异均无显著性(图1A,1B);为更进一步确定心肌细胞收缩功能变化，我们使用心肌细胞收缩检测技术观察单个心肌细胞收缩功能的变化，与心脏超声结果相一致，两组在单个心肌细胞收缩上差异无显著性(图1C,1D)。以上结果说明，心肌肥厚预适应处理对小鼠心脏功能无明显影响。

2．各组小鼠心肌组织形态学及线粒体超微结构变化

HE染色显示，T3D4组小鼠与sham组小鼠在心脏室腔直径、室壁厚度及心肌细胞横截面积间差异无显著性(图2A,2B);WGA染色同样观察到心肌细胞横截面积间差异不显著(图2C,2F);Masson染色显示，血管周围及心肌间质纤维化程度差异无显著性(图2D,2E,2G)。透射电子显微镜下观察发现，心肌肥厚预适应组小鼠心肌线粒体基质密度增高，线粒体嵴数量增加(图2H)，这提示心肌肥厚预适应组小鼠线粒体代谢及生物学功能旺盛。

图2各组小鼠心肌形态学改变

3．各组小鼠心肌线粒体差异蛋白筛选结果

以1.2差异倍数且P<0.05的条件，共筛选出20个差异蛋白。其中T3D4组与sham组相比，有5个蛋白表达上调，15个蛋白表达下调(图3A)，其中上调最显著的蛋白是线粒体核糖体蛋白Gadd45gip1。对筛选出的差异蛋白进行聚类分析，发现sham组和T3D4组区间分布明显，说明两组样本之间差异存在显著性;组内数据比较集中，表明模型组内均一性较好(图3B)。

图3蛋白组学差异蛋白筛选与GO、Pathway分析

4.GO分析和Pathway分析

GO分析发现，差异蛋白共富集到45个组，按P值由小到大进行排序，排列出前20组(图3C;表1)，发现差异蛋白主要汇集于线粒体核糖体、线粒体核糖体亚基、线粒体内膜等。Pathway结果显示，差异蛋白富集最显著的通路是核糖体通路(图3D;表2)。蛋白-蛋白互作分析进一步发现，线粒体核糖体蛋白之间存在相互作用的网络联系(图4A)。

表1GO分析

表2KEGGPathway分析

5.Westernblotting验证关键蛋白水平

我们提取了两组小鼠的心肌组织线粒体蛋白，使用Westernblotting验证Gadd45gip1蛋白在两组小鼠中的表达差异。如图4B和4C所示，心肌肥厚预适应组与对照组相比，Gadd45gip1蛋白水平升高，该结果与蛋白质组学筛选结果相一致。

图4蛋白-蛋白互作网络图及Gadd45gip1蛋白表达Westernblotting验证

讨论

本研究通过建立小鼠心肌肥厚预适应模型，观察心肌肥厚预适应处理后心肌功能及形态学变化，运用线粒体蛋白组学技术，探讨心肌肥厚预适应过程中发生的生物分子改变。结果显示，虽然在心肌肥厚预适应后小鼠心功能及心肌形态未发生明显改变，但在线粒体细胞器超微结构层面却变化显著，体现在线粒体嵴数量增加。由此提示，心肌肥厚预适应后心脏线粒体依赖的能量代谢等相关生物学功能旺盛;线粒体蛋白组学证据也间接应证了这一变化。在筛选出的20个差异表达蛋白中，GO分析发现，上述差异蛋白主要富集在线粒体核糖体、线粒体翻译及嘌呤核糖核苷酸代谢等过程;进一步KEGG通路分析发现，差异蛋白及其相关功能主要汇集于核糖体通路。后续进行的蛋白互作分析发现，线粒体核糖体蛋白相互协同。线粒体相关核糖体较高的表达水平并且具有较强的互作联系，提示线粒体合成及代谢功能维持相对活跃的状态，这与心肌肥厚预适应后心脏线粒体依赖的能量代谢功能旺盛的假设相印证。结合以上证据，我们认为，心肌肥厚预适应带来的对肥厚刺激的抵抗以及延缓心衰进程的保护作用源于其对心脏线粒体能量代谢等生物学过程的促进与支持。

上述证据中，改变最明显的是线粒体核糖体蛋白。结合蛋白组学分析，我们发现，与线粒体核糖体蛋白相关的线粒体翻译过程在肥厚预适应中改变显著。肥厚的心肌细胞需要更多的能量以维持其持续泵血功能，线粒体作为心肌细胞的能量工厂，是其产生ATP的主要场所。线粒体氧化呼吸是产生线粒体产生ATP的最终阶段，因此，线粒体呼吸链复合体(Ⅰ-Ⅴ)的完整及连续性对于ATP的产生至关重要[13]。线粒体呼吸链复合体蛋白除复合体Ⅱ外，均由细胞核与线粒体基因组共同编码[14]。线粒体基因组编码的呼吸链复合体mRNA形成后，经线粒体核糖体蛋白翻译、加工并运输到线粒体内膜上，因此线粒体核糖体蛋白对于维持呼吸链复合体的完整及连续性方面发挥着不可或缺的作用[15,16]。本研究中上调最显著的核糖体蛋白Gadd45gip1，又称为CR6相互作用因子(CR-6interactingfactor1,CRIF1)，该蛋白在2013年首次被发现，它是线粒体核糖体大亚基的重要组成成分(MRPL59)[17]。线粒体核糖体大亚基包含线粒体基因编码的线粒体呼吸链复合体肽基转移酶中心和出口隧道结构，Gadd45gip1与其他位于出口隧道附近的核糖体大亚基蛋白相互作用，并招募分子伴侣(如DnaJ、Tid1)，帮助新生成的线粒体呼吸链复合体多肽链正确折叠并插入线粒体内膜，在线粒体呼吸链复合体的蛋白合成中发挥不可或缺的作用[18]。Gadd45gip1缺失细胞的线粒体结构异常，表现为线粒体基质稀疏，内膜嵴消失，且线粒体氧化磷酸化能力下降[18,19]。由此推测，心肌肥厚预适应过程中，Gadd45gip1蛋白的上调可能与线粒体呼吸链复合体合成增加有关;蛋白-蛋白共表达网络也提示，Gadd45gip1蛋白可能与其他变化的核糖体蛋白一起参与这一过程。

在本实验中，另一表达显著上调的蛋白是Slc25a10，在心肌肥厚预适应过程中上调了1.5倍。Slc25a10是线粒体内膜中的有机酸跨膜转运载体，其可将苹果酸和琥珀酸转运出线粒体，同时交换磷酸盐、硫酸盐和硫代硫酸盐，在维持三羧酸循环底物的平衡中发挥重要作用[20]。Slc25a10的上调可能提示，心肌肥厚预适应中能量代谢和氧化还原状态较为旺盛。肥厚预适应过程中下调最显著的蛋白是Gpam，即线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶1，它催化甘油酯合成的第1步反应[21]，它的下调可能提示线粒体脂肪酸代谢的改变。其他富集到的GO通路有黄素腺嘌呤二核苷酸结合，酰基CoA代谢及嘌呤核糖核苷酸代谢过程等，尚不清楚它们在心肌肥厚预适应中的作用。

综上所述，本研究运用形态学及生物信息学方法分析发现，线粒体核糖体蛋白以及与之密切相关的线粒体呼吸链复合物的合成及装配过程，可能在心肌肥厚预适应过程中发挥着重要作用，由此带来的心脏线粒体能量代谢等生物学功能的重塑可能是心肌肥厚预适应抵抗及延缓心力衰竭进程的重要机制。

辛凯悦,马雷雷,董震,马秀瑞,孙爱军.心肌肥厚预适应小鼠线粒体蛋白质组学分析[J].解剖学报,2020,51(03):378-384.