由于各种原因引起外淋巴和中耳腔之间的骨质破损,或膜性组织和(或)韧带破裂,致使外淋巴和中耳腔交通,称为外淋巴瘘。临床上确诊PLF的方法是经手术探查,显微镜或耳内镜下确认中耳和内耳之间存在瘘孔,瘘孔可位于圆窗或椭圆窗、骨折的骨迷路和异常的镫骨足板,可发生于头部外伤或气压伤、慢性中耳炎或特发性迷路窗膜破裂。近年来发展了一种从中耳检测耳蜗蛋白cochlin-tomoprotein(CTP)也可以确诊为PLF的方法。CTP是由COCH基因编码的一种最短的耳蜗蛋白亚型,在血液、脑脊液和唾液中不表达而在内耳淋巴液中高表达,是一种淋巴管外淋巴特异性蛋白。对疑似有PLF患者的灌洗液进行基于ELISA的CTP检测可以得到准确的检验结果。本文对耳蜗蛋白CTP在PLF诊断中的应用进行综述。

1、PLF诊断的探索

PLF一般出现在头部创伤、气压性创伤或慢性中耳炎症后发生的圆窗或椭圆窗破裂组织、骨迷路骨折或小裂口,也有报道发现其是自发形成,即自发性PLF[1]或特发性PLF。

PLF早在1个多世纪前就被作为一种临床疾病提出,但至今仍存在争议[2],其被广泛使用始于20世纪60年代,最初是在镫骨切除术的早期被发现,由于镫骨切除术后发生了一些迟发型症状,包括耳聋、耳鸣和眩晕,通过中耳探查术发现了来自前庭窗的PLF。随后,关于非手术相关的PLF,如打喷嚏、咳嗽或无外伤史的特发性PLF的病例报道也越来越多。目前,关于特发性PLF的发生和解剖学基础并没有一致的结论。窗前裂、圆窗和前庭窗微裂隙以及耳蜗导水管均被认为与PLF发病相关,其中,窗前裂被认为是PLF最可能的原因[3]。某些解剖说变异或异常如蜗小管过宽、镫骨底板薄弱,均可能造成特发性PLF的潜在危险因素,当这类人群咳嗽或者用力时,更容易发生PLF。

PLF在临床上主要表现为突发性、进行性或波动性的听力下降,平衡失调,阵发性眩晕,耳鸣和耳闷胀感,但确切的症状具有非特异性,特别是在没有外伤史的病例中,PLF的诊断常与特发性感音神经性聋、梅尼埃病或前庭神经炎混淆[4,5]。有研究表明,69例单侧突发感音神经性聋的患者中,19%的患者明确有PLF[6]。但是,对于突聋患者中有多少是PLF造成的,PLF患者中有多少表现为突聋,研究结果差异较大[7]。除了听力下降之外,前庭功能障碍是PLF患者最普遍的主诉,可表现为发作性眩晕、位置性眩晕和平衡失调,眩晕产生的原因可能与外淋巴液流失、空气进入迷路内对耳石器和壶腹嵴产生刺激有关[8]。此外,Goto等[9]报道45例PLF患者中,76%的患者有耳鸣的症状,且耳鸣呈多样性和波动性,表现为流水样,尤其在气压急剧变化、弯腰拿重物、咳嗽等动作时耳鸣加重。

与大多数其他引起感音神经性听力下降和眩晕的原因不同,PLF通常可以通过封堵瘘管手术矫正。准确的诊断和治疗PLF可以改善患者的听力和平衡问题,进而提高患者的生活质量。因此,对于耳科医生来说,PLF是一种可治疗疾病,早诊断早治疗是临床上诊治PLF患者的关键所在。由于PLF的临床表现特征不明显,所以除了辅助检查,如听力学检查、平衡功能检查、影像学检查之外,中耳手术探查一直是确诊PLF的唯一方法,术中发现圆窗、前庭窗及其他部位有明确的外淋巴液溢出就可确诊为PLF。然而,由于这种检测手段是有创性的,并且在没有任何临床症状的轻-中度听力损失或特发性病例中,这种方法很难开展。此外,手术过程本身会导致渗漏和出血,并在圆窗和前庭窗口的壁龛中积聚,这可能被误诊为PLF[10]。长期以来,对PLF的流行病学、发病机制、治疗甚至其是否存在一直存在争论[11,12],这也增加了明确诊断PLF的困难。

在诊断PLF的研究中,报道了一系列用来诊断PLF的内源性外淋巴标志物或者外源性物质如荧光素。如Thalmann等[13]采用高分辨率二维聚丙烯酰胺凝胶电泳,结合氨基酸测序,对血浆、外淋巴液和脑脊液蛋白进行了详细的分析和比较。研究发现,大多数蛋白均存在于内耳外淋巴液中,其存在的浓度水平在外淋巴液和血浆中基本一致,与总蛋白浓度之比约为1∶35。其中,β-痕迹蛋白(前列腺素D合成酶)作为脑脊液漏标志物之一[14],发现在内耳液中的浓度较脑脊液更高,这个特性使其成为可能诊断PLF的一个标记物。然而,由于β-痕迹蛋白的正常淋巴管外周浓度未知,无法将脑脊液漏与PLF区分开来,因此其诊断应用存在一定困难[15,16]。

除此之外,β-2转铁蛋白曾经被普遍认为是诊断PLF的标记物。β-2转铁蛋白存在于脑脊液、眼房水以及外淋巴液中,不存在于血清中。曾经有研究人员收集了在临床上怀疑有PLF的9例儿童的术中中耳漏出液,其中有6例手术中收集的漏出液中含有β-2转铁蛋白,10例非PLF患者的中耳漏出液均为阴性[17]。然而随着大量的临床病例检测,人们对β-2转铁蛋白在外淋巴的自然存在仍有疑问。Levenson等[18]在人工耳蜗植入与镫骨切除术时收集了13例外淋巴样本,发现其中仅有2例样本中β-2转铁蛋白是阳性的,他们的4个对照脑脊液样本均是阳性的。Buchman等[19]同样发现,外淋巴的β-2转铁蛋白检测只有29%的敏感性。通过对β-2转铁蛋白微电泳检测的敏感性进行评估,虽然可以确定其在血清、脑脊液和外淋巴液的微异质性,然而,由于要对样品进行稀释处理和制备,这就降低了内耳液样品的β-2转铁蛋白浓度,使其浓度低于检测阈值。因此,β-2转铁蛋白不能用于确诊PLF[20]。

2、CTP的发现及作用

在对DNFA9这种遗传性聋疾病的研究过程中,研究人员发现了由COCH基因编码的一种蛋白cochlin在内耳耳蜗组织中特异性表达,并且在内耳疾病的致病机制中扮演重要的作用。随着研究的深入,cochlin蛋白的亚型被发现,并且被逐渐检测出其中一个亚型CTP是外淋巴液中存在的特异性蛋白,对PLF诊断具有重要意义。

DFNA9是一种常染色体显性遗传性、非综合征性、进行性感音神经性聋伴前庭病变的遗传性疾病,通过对DFNA9患者的基因组检测,研究人员发现了由COCH基因的3种错义突变,确定了COCH基因突变与遗传性聋DFNA9的发生相关[21]。随着实验检测技术的日益提高,2001年,Ikezono等[22]为了探索DFNA9遗传性聋的发病机制,通过对内耳蛋白进行二维凝胶电泳的蛋白质组学分析,发现了由COCH基因编码的耳蜗蛋白cochlin在遗传性听力损失中发生突变,具有特异性。通过检测发现,COCH基因编码的耳蜗蛋白cochlin占非胶原内耳蛋白的70%,是内耳蛋白中最主要的成分,同时确定了牛耳蜗蛋白的3种亚型,即p63s、p44s和p40s,他们在体内表现出明显的分子异质性。蛋白在电荷和大小上的异质性表明,cochlin在内耳中可能存在高度修饰,这种蛋白的改变可能导致内耳功能的紊乱。

在接下来的研究过程中,Ikezono等[23]通过4种同工异型的抗耳蜗蛋白抗体鉴定了耳蜗蛋白cochlin的亚型。他们发现,在人和牛的内耳组织中检测到相同的3种耳蜗蛋白亚型,即p63s、p44s和p40s。然而,在外淋巴中未检出p44s和p40s。另外,在人的内耳外淋巴液中,研究人员发现了一种新且短的16kDa亚型,另一种18～23kDa亚型则存在于牛的内耳外淋巴液中,这2种亚型被命名为CTP。CTP只存在于耳蜗外淋巴液,不存在于内耳的其他组织。由于耳蜗蛋白cochlin对内耳的高度特异性,研究人员推测CTP也可能对外淋巴液具有特异性。

COCH基因编码的蛋白cochlin在内耳中强表达[24],其全长分子量大小为p63s,有2个功能域,1个功能未知的LCCL结构域和1个可能作为胶原结合位点的vWF-A样结构域。通过电镜观察研究发现,耳蜗蛋白与Ⅱ型胶原蛋白具有共同的结合位点[25],CTP的整个分子仅由一个LCCL结构域组成,之前在DFNA9中所报道的COCH基因所编码的蛋白cochlin的大部分突变都位于这个结构域,因此,CTP也可能是了解耳蜗功能和DFNA9病理生理机制的重要分子。

3、CTP的检测

3.1Westernblot检测

为了确定耳蜗外淋巴特异性蛋白CTP是否可以作为诊断PLF的标志物,Ikezono等[26]自从2009年以来,采用Westernblot检测了CTP在外淋巴液、血清、唾液、脑脊液等多种体液中的表达特性。他们收集了经迷路前庭神经鞘瘤手术、耳硬化镫骨切除术或人工耳蜗植入手术时的外淋巴液样本20个,另外28个血清样本、20个脑脊液样本和29个唾液样本作为对照组。通过之前的研究发现,CTP的整个分子仅由1个LCCL结构域组成,因此,使用LCCL结构域中的第114～127残基所对应的14个肽来生成抗体,即兔多克隆抗CTP抗体,用来作为一抗,用于Westernblot中蛋白的检测。Westernblot检测发现,CTP(16kDa)在20个外淋巴样本中均有表达,但在28个血清样本、20个脑脊液样本和29个唾液样本均无表达。同时,在之前的研究他们预测了一个假定的CTP序列(即cDNA的101～403位点),通过PCR法,克隆出人重组CTP蛋白(rhCTP),对连续稀释的人重组CTP进行检测,来确定CTP的检测浓度范围。最终,确定在Westernblot分析中,rhCTP的检测范围限定为0.27～0.14ng/孔,外淋巴中CTP的平均检测限定值是0.022μL/孔。该检测可为临床应用CTP作为PLF的诊断指标提供依据。

除此之外,Ikezono等[27]在另一个临床研究中,通过之前确定的Westernblot检测的标准化CTP检测方法,发现在55例非PLF患者中,54例患者的中耳灌洗液中CTP检测呈阴性,蛋白检测特异性为98.2%。同时也确定了CTP是一种稳定的蛋白质,其检测不受贮藏、冻融的影响。在随后的临床研究中,Ikezono等[28,29,30]一直使用Westernblot技术检测CTP,并报道了耳蜗植入术后淋巴管井喷患者的淋巴液、穿透性中耳损伤后的中耳液和翻修性镫骨手术后的耳蜗液中的CTP。这些结果进一步证实了CTP是一种稳定的外淋巴特异性蛋白,CTP检测是临床建立的第1个高特异性检测PLF的诊断工具。并且通过封闭PLF的瘘口,PLF所产生的临床症状,患者的听力和平衡可以改善。所以,通过Westernblot检测CTP早期识别PLF对于临床患者治疗及预后具有重大的意义。

3.2ELISA检测

尽管在之前的研究中,已经可以确认外淋巴CTP的Westernblot分析可以作为诊断PLF的标记物,但是Westernblot检测系统也存在着一些缺点,如需要较大的样本容量,一次性处理的样本数量较少,识别阳性率时依赖于主观判断。因此,需要探索一种新的方法,准确而较为简单地检测出外淋巴中的CTP。多克隆抗体ELISA试剂盒满足这个条件,这种检测手段不仅可以提高CTP检测的准确性,还有利于临床上大规模的病例研究,是目前被临床认可和接受的诊断PLF的检测方法。

与Westernblot检测一样,首先,Ikezono及其团队利用从人类基因组中相应基因序列推导出的人耳蜗蛋白氨基酸序列,生成了免疫组织化学中需要的抗CTP抗体,再用样品和标准化的rhCTP蛋白质通过ELISA检测确定CTP的检测浓度范围为0.20～1.56ng/mL[31]。他们在手术过程中收集的2种不同类型的中耳灌洗液样本,一种为圆窗上有瘘孔,切开圆窗后收集的中耳灌洗液(含有外淋巴液),另一种为没有看到瘘孔,圆窗完整,仅仅是因为鼓膜异常或者耳硬化症造成中耳积液的中耳灌洗液样本(不含外淋巴液)。通过分析由2种不同中耳灌洗液样本中的CTP构建的ROC曲线,可以得出以下结论:①在区分PLF与非PLF时具有很高的诊断准确性;②根据检测结果,结合灵敏性和准确性,可将诊断PLF的诊断标准定义为:CTP<0.4ng/mL阴性;0.4ng/mL≤CTP<0.8ng/mL中间;CTP≥0.8ng/mL阳性。

由于hCTPELISA检测CTP具有较高的敏感性和特异性,因此对在门诊上疑似PLF的患者,常规的鼓膜切开术后[32],用生理盐水(0.3mL)冲洗中耳腔得到中耳灌洗液,即可检测是否含有CTP,此方法易于开展,方法简便。

当然,hCTP酶联免疫吸附试验的仍有一些局限性。中耳灌洗液可能含有多种物质,在目前的hCTPELISA中,我们还没有完全检测出哪些成分可能导致假阴性或假阳性反应。需要考虑的另一个因素是血液中的CTP。虽然血液中CTP含量很低(0.28～0.45ng/mL),而且在40个样本中只有2个检测到,但这也说明在人血清或者血浆中可以检测到CTP。但是由于在收集中耳灌洗液时,可能存在于灌洗液中的血液被大量的生理盐水稀释,所以对于CTP阳性或者阴性判断的影响较小。

总体来说,通过hCTPELISA方法检测CTP,方法简便,易于操作(只需得到中耳灌洗液),同时具有较高的敏感性和特异性,可用于临床上快速诊断PLF和大规模的病例研究,对PLF患者的诊断治疗具有重大意义。

4、总结

综上所述,耳蜗蛋白CTP是存在于外淋巴液中的一种高度特异性蛋白,中耳灌洗液中CTP的检测对淋巴管外瘘的检测具有较高的敏感性,在临床上通过对疑似PLF患者的中耳灌洗液做基于CTP的ELISA检测,对临床医生早期诊断和治疗PLF具有重要的意义。

熊潇,于进涛,孙宇.耳蜗蛋白cochlin-tomoprotein在外淋巴瘘诊断中的应用[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2020,34(09):857-861.