糖尿病，中医谓之“消渴”，临床具有阴津亏损、饮食不节、体形肥胖等表现。在西医理论中，糖尿病是一种以高血糖为特征的常见代谢性内分泌疾病。根据糖尿病的发病机制进行划分，主要有I型糖尿病和II型糖尿病。由于糖尿病具有发病率高、并发症多的特点，已成为危害人类健康的高发疑难疾病。复方黄芪降糖颗粒（FFHQ）是中国科学院长春应用化学研究所自主研发的中药复方，由黄芪和白芍等中药组成。黄芪中主要含有三萜皂苷类、多糖类和黄酮类三大类成分，此外还含有亚油酸、亚麻酸、绿原酸和微量元素等多种化学成分。三萜皂苷类为黄芪中主要的有效成分，黄芪甲苷含量最高[1]。Jiang等[2]研究发现，黄芪甲苷通过诱导脂肪细胞的TNF-分泌，降低3T3-L1脂肪细胞的脂解作用，改善胰岛的耐受性。此外，吕琳[3]研究表明，黄芪甲苷可以通过抑制肝脏中糖原磷酸化酶和葡萄糖-6-磷酸酶的活性，进而减少肝糖原的分解和葡萄糖的氧化，从而发挥其降糖作用。宋恩峰等[4]在黄芪提取物降糖作用的研究中给予STZ所致的糖尿病大鼠灌胃给药黄芪注射液（5mg/kg），发现黄芪注射液可以显著改善大鼠蛋白尿、肾脏肥大、肾脏病变等症状，说明黄芪提取物对糖尿病并发症有一定的疗效。张利[5]通过对白芍药理作用的研究进展进行总结发现，白芍提取物的主要成分为萜类及苷类、黄酮类、多糖类和鞣质类化合物，而白芍总苷（TGP）是其中主要的有效成分，以单萜苷类化合物为主[6]。张蔷等[7]研究发现，TGP可以从提高胰岛素敏感性、改善脂质代谢和降低尿蛋白排泄等几个方面发挥保护糖尿病动物肾脏的作用。研究发现以TGP灌胃给药8周后，糖尿病大鼠肾组织中的p38MAPK磷酸化、NF-Bp65的表达均下降，表明TGP可能是通过抑制p38MAPK信号通路和激活NF-B来实现对糖尿病肾脏的保护作用[8]。TGP可以降低糖尿病大鼠24h尿白蛋白排泄率，且该作用呈剂量依赖性；Western-blot结果表明TGP给药8周可显著下调肾组织中p-JAK2、p-STAT3和1(IV）型胶原蛋白的表达，表明TGP可能通过抑制肾脏JAK/STAT信号通路的激活发挥改善糖尿病大鼠早期肾损害的作用[9,10]。

本研究旨在通过糖尿病小鼠模型和体外HepG2细胞胰岛素抵抗试验，考察FFHQ对糖尿病小鼠空腹血糖（GLU）、糖耐量（GT）、糖原水平、血清胰岛素水平、胰岛素抵抗等各项糖尿病相关指标的影响，进而评价复方黄芪降糖颗粒的降糖作用，同时对其作用机制进行初步探讨。

1、材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1试验材料

复方黄芪降糖颗粒（FFHQ）由中国科学院长春应用化学研究所自制，每1g颗粒相当于饮片0.84g，其中含黄芪0.21g、白芍0.21g。

1.1.2实验动物

试验用小鼠为雄性昆明小鼠，体重为18～22g（吉林大学实验动物中心提供）

1.1.3试剂

四氧嘧啶（ALX)(Sigma公司）；阿卡波糖（德国拜耳公司）；胰岛素（Insulin,Ins）、二甲双胍（Aladdin公司）；高糖改良的eagle培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）（美国Life公司）；糖原含量测定试剂盒、小鼠胰岛素ELISA检测试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；葡萄糖测定试剂盒（上海荣盛生物药业有限公司）；柠檬酸、柠檬酸钠（上海前尘生物科技有限公司）；血糖仪、血糖试纸（北京怡成生物电子技术股份有限公司）；HepG2细胞系（中国科学院上海细胞库）。

1.2仪器与设备

TECANGENios酶标仪（瑞士Tecan公司）；Centrifuge5810R型冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；HX-200A型中药粉碎机；SanoriusBSl10S分析天平（北京赛多利斯有限公司）；96孔板（美国Corning公司）；BB15CO2细胞培养箱（美国Thermo公司）。

1.3方法

1.3.1四氧嘧啶型糖尿病小鼠模型的构建

试验用小鼠禁食38h后，尾静脉注射ALX75mg/kg，给予普通饲料，饲养84h后，禁食12h，剪尾取血，测定血糖值，若测定值大于16mmol/L，则造模成功，给予普通饲料喂养。

1.3.2小鼠分组及给药

试验动物共分为7组，每组10只分别为模型组、空白组、高剂量组、中剂量组、低剂量组、阳性对照组、空白给药组。FFHQ按成人每日推荐食用量20g，体重以60kg计，相当于0.33g/kg，扩大5、10、20倍，给药量分别为1.65、3.30、6.60g/kg，依次作为FFHQ-L、FFHQ-M、FFHQ-H组，灌胃给药；阳性对照组灌胃二甲双胍溶液（0.0025g/kg）；空白组和模型组以蒸馏水灌胃（0.02mL/g）；空白给药组以FFHQ高剂量灌胃（5.6g/kg）。各组小鼠给药剂量见表1，每日1次，连续给药30d。

1.3.3HepG2细胞胰岛素抵抗试验[11,12]

HepG2细胞在DMEM高糖培养基（含10%FBS、1%双抗）中培养，置于饱和湿度为5%、温度为37℃的CO2细胞培养箱中，细胞贴壁长满后，用胰蛋白酶消化，传代。将细胞（处于对数生长期）以5104cells/孔接种于96孔板，置于培养箱中孵育24h，待细胞贴壁后弃去培养液，以其中6个细胞孔作为正常对照，其余细胞孔用于造模。

将HepG2细胞分为模型组、阳性对照组（二甲双胍）、FFHQ降糖颗粒提取物组每组6个复孔。空白组细胞孔内加入5%FBS的高糖DMEM培养液200L，模型组细胞孔内加入含106mol/L胰岛素、1%FBS的高糖DMEM培养液200L，培养48h弃去培养液，待胰岛素抵抗模型成功，根据分组情况加入相对应的培养液200L，置于培养箱中培养24h后，测定上清中葡萄糖的含量，计算消耗量，另用MTT比色法检测细胞的增殖情况。分组如下：

空白组：正常细胞+200L含109mol/L胰岛素、1%FBS的高糖DMEM培养液；

模型组：造模细胞+200L含109mol/L胰岛素、1%FBS的高糖DMEM培养液；

阳性对照组（二甲双胍）：造模细胞+200L含109mol/L胰岛素、1%FBS、0.1mg/mL二甲双胍的高糖DMEM培养液；

FFHQ组：造模细胞+200L含109mol/L胰岛素、1%FBS、0.1mg/mLFFHQ提取物的高糖DMEM培养液。

1.4指标测定

1.4.1小鼠GLU和GT

给药30d后，禁食12h。末次灌胃给药30min后，小鼠进行剪尾采血，用血糖试纸和血糖仪测定GLU，以此为GT0min血糖值。葡萄糖以2.0g/kg灌胃各组小鼠，于30、60、120min测定血糖值。记录各时间点的血糖值，并计算血糖曲线下面积(AUC）。

血糖曲线下面积（AUC)=0min（血糖测定值）0.25+30min（血糖测定值）0.5+60min（血糖测定值）0.75+120min（血糖测定值）0.5

1.4.2小鼠血清胰岛素、肝糖原、肌糖原含量

各组小鼠在末次给药后，禁食（不禁水）12h，摘眼球取血，低温静置30min后离心10min(3000r/min），分离血清，采用小鼠胰岛素试剂盒测定血清胰岛素的含量。摘眼球取血后，处死动物，迅速取出肝脏、右侧大腿后肢肌肉，采用糖原试剂盒测定肝糖原、肌糖原含量。

1.4.3HepG2细胞葡萄糖消耗量（GC）取1

L上清培养液至96孔板，加入100L葡萄糖氧化酶工作液，37°C培养15min，测定在505nm处的吸光度（A），并与空白培养液的A比较，计算培养液葡萄糖浓度。葡萄糖消耗计算公式：

公式1

1.4.4HepG2细胞MTT测定

弃去待检测MTT细胞的原培养液，每孔加入20L5mol/LMTT溶液，37℃孵育240min后弃去孔内溶液，加入100LDMSO,37℃振荡培养10min，测定570nm处吸光度。

1.5数据统计

数据均以±SD表示，组间比较用t检验，所得数据经SPSS10.0统计软件进行统计分析。

2、结果与分析

2.1FFHQ对四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠的影响

2.1.1FFHQ对GLU和GT的影响

经FFHQ给药30d治疗后测定各组小鼠的GLU，结果见表1。在30d试验中，空白组、空白给药组的GLU相比较，无统计学意义，说明FFHQ对正常动物血糖无影响。给药30d中，模型组一直保持高GLU水平，总体呈现略有上升的趋势；给药30d后，高剂量组（FFHQ-H）、中剂量组（FFHQ-M）、低剂量组（FFHQ-L）、阳性对照组的小鼠GLU与模型组相比均显著降低（P<0.01或P<0.05）。同时，空白组、空白给药组GLU比较无显著性差异，说明FFHQ对正常动物血糖无影响。

表1FFHQ对小鼠GLU和GT的影响

糖耐量试验需要测定0、30、60、120min血糖值，其中0min血糖代表GLU,30、60、120min3个时间点的血糖测定值可以反映出药物对GT的影响。曲线下面积（AUC）如表1所示，糖耐量曲线见图1。由图1可知，各治疗组小鼠以葡萄糖溶液（2g/kg）灌胃后60、120min时的血糖值均明显低于模型组，AUC明显降低（P<0.01），表明FFHQ能够有效提升GT，各治疗组作用效果相当。

2.1.2FFHQ对血清胰岛素、肝糖原和肌糖原含量的影响

ALX通过对胰岛B细胞的不可逆性损伤导致Ins分泌绝对不足，从而使得血清中胰岛素水平显著降低，血糖升高。各组小鼠血清胰岛素测定结果如表2所示，与空白组相比，模型组小鼠血清中胰岛素含量明显降低，符合ALX型糖尿病疾病模型特征。各治疗组中，高剂量（FFHQ-H）、中剂量（FFHQ-M）组血清中胰岛素含量显著高于模型组（P<0.05），而低剂量组血清中胰岛素含量与模型组相比并未显著升高，说明FFHQ在低剂量下，并不能促进血清中胰岛素分泌。

图1不同给药组GT曲线

表2FFHQ对血清胰岛素、肝糖原和肌糖原含量的影响

糖原的合成对于血糖的稳定具有重要的意义，肝糖原、肌糖原的含量可以说明FFHQ是否经过此途径发挥降血糖的作用。各组小鼠肝糖原、肌糖原的含量测定结果如表2所示。模型组肝脏和肌肉中的糖原含量与空白组相比显著降低；经FFHQ治疗后的高、中剂量组，阳性对照组肝糖原、肌糖原含量显著增加（P<0.01或P<0.05），而低剂量组虽略有增加但不具有统计学意义。

四氧嘧啶通过选择性破坏动物胰岛细胞，阻断胰岛素分泌，使血糖升高，常用来建立糖尿病小鼠模型。造模成功的小鼠会出现不同程度的多饮、多食、多尿、体重减轻等症状，经过30d的治疗，各治疗组上述症状均有好转。试验结果表明，各治疗组均表现出良好的降血糖效果。高、中剂量组均能够显著地下调GLU、提升GT、增加肝糖原和肌糖原含量、促进胰岛素分泌。而低剂量组虽能够显著地下调GLU、提升GT，但在增加肝糖原和肌糖原含量、促进胰岛素分泌方面作用效果较弱。

2.2HepG2胰岛素抵抗试验结果

各给药组对HepG2胰岛素抵抗的影响如表3所示。

表3FFHQ对HepG2胰岛素抵抗的影响

HepG2胰岛素抵抗体外细胞试验是目前应用较广泛的研究胰岛素抵抗机制的模型，可用于筛选和研究改善胰岛素抵抗作用的药物。本试验采用MTT比色法对最终细胞的增殖情况进行了检测，测定结果见表3。由表3可知，各试验组测定结果没有明显差异，表明各试验组虽然在诱导、给药阶段的细胞培养液成分存在差异，但细胞数目和细胞生长活力相对一致，从而保证了采用该胰岛素抵抗模型对药物进行筛选的准确性、客观性和有效性。

由HepG2胰岛素抵抗模型试验结果可知，模型组由于胰岛素抵抗的产生，在24h内，对于低浓度水平胰岛素（109mol/L）刺激下的葡萄糖消耗量明显低于空白组，而其他各组的葡萄糖消耗量明显增加，胰岛素抵抗状态的HepG2细胞对葡萄糖的消耗量恢复至正常水平。表明，FFHQ具有改善胰岛素抵抗的作用。

3、结论

本研究利用四氧嘧啶诱导建立糖尿病小鼠模型和高浓度胰岛素诱导的HepG2细胞的胰岛素抵抗模型，对复方黄芪降糖颗粒的降血糖药效及作用机制进行研究。结果表明，灌胃给药治疗（30d）后，FFHQ能明显降低糖尿病小鼠的GLU，改善GT，具有明显降血糖的作用；通过对其作用机制的研究，结果表明FFHQ通过提高GT、促进胰岛素分泌、增加肝糖原和肌糖原含量、改善胰岛素抵抗来发挥药效。

参考文献：

[1]孙政华,邵晶,郭玫.黄芪化学成分及药理作用研究进展[J].中医临床研究,2015,7(25):22-25.

[3]吕琳.黄芪甲苷对高脂加链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠的降血糖作用及其作用机制[D].广州:南方医科大学,2010.

[4]宋恩峰,刘晶晶,贾汝汉,等.黄芪对2型糖尿病大鼠肾脏结缔组织生长因子的影响[J].中国中西医结合肾病杂志,2008,9(5):431-433.

[5]张利.白芍的药理作用及现代研究进展[J].中医临床研究,2014,6(29):25-26.

[7]张蔷,高文远,满淑丽.黄芪中有效成分药理活性的研究进展[J].中国中药杂志,2012,37(21):3203-3207.

[8]吴芳,杜伟锋,徐姗姗,等.白芍化学成分及质量评价方法研究进展[J].浙江中医药大学学报,2012,36(5):613-615.

[10]苏静,吴永贵,张晶晶,等.白芍总苷对糖尿病大鼠肾组织JAK/STAT信号通路的调节作用[J].中国现代医学杂志,2009,19(3):362-366.

[11]方飞.桑叶有效部位改善HepG2胰岛素抵抗及其机制的研究[D].广州:华南理工大学,2012.

[12]罗勇会,张翠香,徐春萍.饥饿小鼠和饱食小鼠肝糖原含量及血糖的比较[J].生命科学仪器,2012,10(4):25-27.

张亚楠,赵琼玥,岳可心,宋凤瑞,刘志强,皮子凤.复方黄芪降糖颗粒对四氧嘧啶致高血糖小鼠的降糖作用研究[J].特产研究,2020,42(02):27-31.

基金:吉林省科技发展计划(20150311039YY)