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肺癌细胞应用COX-2抑制剂联合顺铂通过Wnt-β-catenin信号通路对其增殖与凋亡的影响

2020-07-16 158 上传者：管理员

摘要：目的观察研究COX-2抑制剂(塞来昔布)联合顺铂对肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响，及与Wnt/β-catenin信号通路的关系。方法以人肺腺癌A549细胞为研究对象，实验分为:对照组、塞来昔布组、顺铂组、联合组。MTT法检测A549细胞增殖情况，流式细胞术检测A549细胞周期变化，Hoechst3358染色法检测A549细胞凋亡率，免疫荧光法检测A549细胞Wnt、β-Catenin、c-myc蛋白表达，RT-PCR方法检测Wnt、β-Catenin、c-mycmRNA水平变化。结果塞来昔布组、顺铂组、联合组较对照组细胞抑制率和凋亡率均增高(P<0.05)，以联合组细胞抑制率和凋亡率均最高(P<0.05)。塞来昔布组、顺铂组、联合组较对照组处于G0/G1期细胞增多、处于S期和G2期细胞减少(P<0.05)，以联合组处于G0/G1期最多、处于S期和G2期细胞最少(P<0.05)。塞来昔布组、顺铂组、联合组较对照组细胞Wnt、β-Catenin、c-myc蛋白和mRNA均降低(P<0.05)，以联合组细胞Wnt、β-Catenin、c-myc蛋白和mRNA降低最显著(P<0.05)。结论塞来昔布联合顺铂可以抑制肺腺癌A549细胞Wnt/β-catenin信号通路，这可能是其抑制结肠癌细胞增殖、促进凋亡的重要机制。

关键词：
COX-2抑制剂
细胞凋亡
细胞增殖
肺癌
顺铂
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肺癌无论是发病率还是死亡率均高居全世界恶性肿瘤之首。虽然当今肺癌治疗手段有很大发展，但其预后仍然较差。以铂类为主的联合化疗方案仍然是目前肺癌治疗的重要手段，常规化疗虽然取得了较大的进步，但是大剂量、多疗程、多联合化疗会加剧患者毒副作用、严重抑制免疫系统，使得机体的免疫力下降，严重损伤患者的机体。同时化疗药物产生的耐药性成为肺癌治疗的难点[1]。肺癌的发病是1个多因素、多阶段、多基因及多信号通路共同作用的复杂机制，Wnt/β-catenin信号通路的异常激活在肺癌的发生、发展中也起着重要作用[2]。近年来COX-2抑制剂的抗肿瘤作用日益受到人们的关注，其可以通过多种途径对肿瘤生长产生抑制作用[3]。因此，本研究拟以肺腺癌A549细胞系为研究对象，研究探讨COX-2抑制剂(塞来昔布)联合顺铂对肺腺癌细胞增殖和凋亡的影响，以及与Wnt/β-catenin信号通路之间的关系，为两药联合应用临床治疗肺癌提供实验和理论依据。

1、材料与方法

1.1主要药品和试剂

人肺腺癌A549细胞株购于中科院上海细胞库，塞来昔布胶囊(西乐葆)(0.2g，辉瑞制药有限公司，批准文号:国药准字J20180063)，注射用顺铂(冻干型)(10mg，齐鲁制药有限公司，批准文号:国药准字H20183652);RT-PCR试剂盒购于日本TaKaRa公司，MTT试剂盒购于美国Sigma公司;兔抗人Wnt、β-Catenin和c-myc单克隆抗体均购于美国Abcam公司，GAPDH单克隆抗体、FITC标记羊抗兔IgG购于武汉博士德生物工程有限公司;Hoechst3358试剂染液购于北京百奥莱博科技有限公司，TUNEL试剂盒购于美国罗氏公司，ABIPrism7500型荧光定量PCR仪购于美国应用生物系统公司，流式细胞仪购于美国CST公司。

1.2方法

1.2.1人肺腺癌A549细胞培养

肺腺癌A549细胞株培养于含10%胎牛血清、青链霉素(青链霉100U/ml，链霉素100μg/ml)的RPMI-1640培养基，于37℃、95%饱和湿度，5%CO2培养箱，每2d更换一次培养基，实验均取处于对数生长期的细胞，制备成单细胞悬液。

1.2.2细胞药物处理及分组

塞来昔布去除糖衣后溶解于DMSO制成浓度为0.1mmol/l母液，实验用PBS溶液稀释至目标浓度，保持终溶液DMSO浓度<0.1%。取对数生长期肺腺癌A549细胞5×105/ml接种于6孔板，培养24h后吸出孔内培养液，加入相应药物，实验分组:对照组(不加任何药物);塞来昔布组(塞来昔布;25μmol/l);顺铂组:(顺铂;1mg/l);联合组:(塞来昔布;25μmol/l+顺铂;1mg/l)，均以RPMI1640培养液配置浓度。

1.2.3甲基偶氮哇盐法(MTT)检测细胞细胞活力检测

取对数生长期细胞制成单细胞悬液，每孔按100μl(1×104/孔)接种于96孔培养板中培养，24h后分别加入不同处理药物及全培养液的空白对照组，置常规培养箱中培养48h后，分别培养0h、24h、48h、72h时间后每孔加入MTT溶液20μl(50mg/ml),37℃孵育4h;去除上清液，每孔加150μlDMSO，酶标仪检测每孔波长490nm吸光度值(A值)，求其平均值，并计算细胞抑制率，抑制率(E)=(1-实验组平均A值/对照组平均A值)×100%，并绘制细胞生长抑制曲线。

1.2.4流式细胞术检测细胞周期的变化

接种A549细胞24h后分别加药，48h后收集细胞，PBS洗2次，参照检测试剂盒说明书逐步操作，最后流式细胞仪上机检测，采用软件分析细胞周期分布变化。

1.2.5Hoechst3358染色法检测细胞凋亡率

接种A549细胞24h后加药，48h后收集不同处理组细胞，4%多聚甲醛固定20min，添加10μg/mlHoechst3358的染液，37℃孵育30min，荧光显微镜观察随机选择至少10个观察视野，计算细胞凋亡率(%)=凋亡阳性细胞数/细胞总数。

1.2.6免疫荧光法检测细胞Wnt、β-Catenin蛋白的表达

以5×105/ml细胞接种盖片上，24h后分组处理，孵育48h后，取出细胞爬片，预温PBS洗涤，4%预冷多聚甲醛固定20min,PBS洗涤;0.2%TritonX-100通透10min,PBS洗涤;山羊血清封闭30min,PBS洗涤;添加Wnt和β-Catenin一抗(1∶200),4℃湿盒过夜，PBS洗涤;FITC标记二抗(1∶200),37℃避光孵育1.5h,PBS洗涤;甘油封片，荧光显微镜采片。

1.2.7Real-TimePCR方法检测Wnt、β-Catenin和c-myc的mRNA水平

参照Trizol试剂说明书操作提取总RNA,-80℃保存备用，鉴定总RNA浓度及纯度。采用Real-TimePCR试剂盒，按照上面反应体系进行cDNA的合成逆转录反应体系。基因引物序列:GAP-DH:上游5'-CAGAGTGGACGGATTTTGGTCCTAT-3'，下游:5'-ATCCTTCTCAATCGTGGTGATGTC-3';Wnt:上游:5'-CAGTGAGCTGGTTGTCACCT-3'，下游:5'-CT-GAGCTGCTCCTTGAAGTG-3';β-Catenin上游:5'-CAAG-GAGCAGGTAATCGCAAGT-3'，下游5'-GGAAC-CAGAATGGGAGAAACG-3';c-myc:上游:5'-TGAG-GAAACGACGAGAACAG-3'，下游:5'-ACGAGAGATTC-CAGCTCCCTTGATTCAAACGC-3'。ABIPrism7500型荧光定量PCR仪中扩增，反应条件:95℃预变性2min,95℃变性15s,60℃退火2min,40个循环。以内参GAPDH进行标准化，采用2-△△Ct法计算基因的相对表达量。

1.3统计学分析

应用SPSS20.0进行统计学分析，计量资料用表示，采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1细胞增殖能力

塞来昔布组、顺铂组、联合组较对照组细胞抑制率增高，细胞增殖能力下降(P<0.05)，尤以联合组细胞抑制率最高，细胞增殖能力最低(P<0.05);且各组对细胞的杀伤效应呈时间依赖性，见图1。

图1MTT检测各组细胞增殖生长状况

2.2细胞周期变化

塞来昔布组、顺铂组、联合组较对照组处于G0/G1期细胞增多(P<0.05)，以联合组处于G0/G1期细胞最多(P<0.05);塞来昔布组、顺铂组S期、G2期细胞减少(P<0.05)，以联合组处于S期、G2期细胞最少(P<0.05)，见表1。

表1流式细胞仪检测细胞周期变化

2.3细胞凋亡率

对照组细胞较多，无边聚，胞质染色均匀一致，荧光较弱;联合组细胞较少形态饱满，形状规则，染色较深、染色质浓集、荧光强，细胞核呈现核固缩浓染，核分叶呈月牙状或蚕豆状，碎裂呈米粒状大小不等的碎片，形成凋亡小体。对照组、塞来昔布组、顺铂组、联合组凋亡率分别为:(0.78±0.04)%、(32.56±1.67)%、(25.67±1.98)%、(63.37±2.12)%。塞来昔布组、顺铂组、联合组较对照组细胞凋亡率增高(P<0.05)，尤以联合组细胞凋亡率最高(P<0.05)。

2.4Wnt、β-Catenin和c-myc的蛋白表达

Wnt主要表达于A549细胞胞膜和胞质，β-Catenin主要表达于A549细胞胞质，c-myc主要表达于A549细胞胞质。对照组细胞Wnt、β-Catenin和c-myc荧光很强，塞来昔布组和顺铂组荧光强度减弱，联合组荧光强度显著减弱。塞来昔布组、顺铂组、联合组较对照组细胞Wnt、β-Catenin和c-myc的蛋白均降低(P<0.05)，以联合组降低最显著(P<0.05)，见表2。

2.5Wnt、β-Catenin和c-myc的mRNA表达

塞来昔布组、顺铂组、联合用药组较对照组细胞Wnt、β-Catenin和c-myc的mRNA表达均降低(P<0.05)，其中以联合组降低最显著(P<0.05)，见表3。

3、讨论

非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的80%。含铂化疗方案是目前NSCLC一线标准化疗方案[4]。而目前化疗药物由于缺乏特异性，毒性反应成为使用剂量受到限制的关键因素，且化疗过程中耐药现象，同时也使患者的依从性和耐受性降低，影响远期疗效和患者的生存质量。环加氧酶(cyclo-oxygenase,COX-2)过度表达与肿瘤的发生、发展密切相关，COX-2促进合成大量前列腺素，提高肿瘤的免疫耐受，降低宿主抗恶性肿瘤免疫监视，导致肿瘤细胞增殖[5]。COX-2抑制剂可抑制其催化产物前列腺素E2的合成，促进干扰素γ及TNF-α产生而恢复和维持免疫平衡，提升免疫监视功能，增加细胞杀伤能力，抑制肿瘤生长，发挥增强免疫的机制[6]。选择性COX-2抑制剂塞来昔布已经证实其对多种肿瘤细胞有很好的抑制作用，化疗药物联合选择性COX-2抑制剂可降低单纯化疗药物所引起的不良反应，具有协同化疗药物通过调节细胞因子，增强机体细胞免疫，杀伤抑制癌细胞生长，从而增强化疗药物敏感性及疗效，还可以减轻化疗药物的毒性，克服化疗药物的耐药性问题[7]。

Wnt/β-catenin信号通路在肺癌发病中发挥了非常重要的作用，其依赖于β-catenin表达调控，参与多种肿瘤的发生、发展的相关作用机制，涉及肿瘤细胞信号传导、细胞周期、细胞增殖、凋亡以及细胞黏附、浸润、转移等一系列过程[8]。Wnt信号异常活化，转导细胞内的信号，Wnt配体与其受体结合，β-catenin被活化，在胞浆异常大量聚集，并进入胞核，并与AxinAPC-GSK-3β形成复合物，与核内转录因子T细胞因子(TCF)/淋巴结增强因子(LEF)相结合，激活下游cyclinD1、Survivin、c-myc等细胞周期相关靶基因的转录，导致肿瘤细胞异常增殖、浸润和转移[9,10]COX-2抑制剂通过药抑制肿瘤细胞胞质内β-catenin向核内转移，减少Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因异常表达，从而抑制肺癌的发展[11]。

表2免疫荧光检测A549细胞Wnt、β-Catenin和c-myc的表达

表3RT-PCR法检测A549细胞Wnt、β-Catenin和c-myc的mRNA表达

本研究表明，COX-2抑制剂(塞来昔布)和顺铂单独及联合应用均能抑制肺癌细胞增殖，促进癌细胞凋亡，降低Wnt、β-Catenin和c-myc蛋白表达，下调Wnt、β-Catenin和c-myc的mRNA表达，且两药联合效应优于各自单独用药，表明两药联合应用可以共同抑制COX-2-Wnt/β-catenin信号通路，进而抑制其下游靶基因c-myc水平表达。因此，Wnt/β-catenin信号通路的活化状态的变化必然会引起其下游靶基因c-my水平的变化。王玲婵等[12]研究表明艾瑞昔布联合洛铂能够抑制非小细胞肺癌侵袭和转移，艾瑞昔布对洛铂化疗可能具有增敏作用。熊建萍等[13]研究发现COX-2抑制剂塞来昔布联合顺铂可增强对A549人肺腺癌细胞的生长抑制效应。陈刚等[14]研究表明塞来昔布可抑制人肺癌裸鼠移植瘤的生长和血管生成。塞来昔布与奥沙利铂联合应用提高了奥沙利铂的抗肿瘤效果。

综上所述，塞来昔布联合顺铂可协同抑制肺癌细胞生长增殖，促进细胞凋亡，发挥协同抗肿瘤作用，其作用机制可能为两药通过共同抑制Wnt/β-Catenin信号通路，进而发挥协同抗肿瘤的效应。为临床上两药联合应用治疗肿瘤患者提供一定的实验及理论基础。随着本研究的不断深入，Wnt/β-catenin信号通路调控肺癌的关系网络将更加清晰，将更加全面揭示COX-2抑制剂抑制肿瘤，联合化疗药增效的作用机制，为塞来昔布治疗肺癌提供新的实验依据。同时，塞来昔布的最佳剂量、毒副反应等也尚有待于动物实验以及临床实验进一步研究证实。

参考文献：

[12]王玲婵,崔立静,王东昌,等.艾瑞昔布抑制肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤侵袭和转移及其机制[J].中国癌症杂志,2017,27(1):1-6.

[13]熊建萍,陶庆松,张凌,等.环氧化酶-2抑制剂塞来昔布联合顺铂对A549人肺腺癌细胞株增殖影响的体外实验研究[J].实用癌症杂志,2006,21(1):4-6.

[14]陈刚,赵士彭,赵志芳,等.塞来昔布联合奥沙利铂对人肺癌裸鼠移植瘤的治疗作用及其作用机制的研究[J].中国肿瘤临床,2008,35(1):49-53.

赵一波,邢述.COX-2抑制剂联合顺铂通过Wnt/β-catenin信号通路对肺癌细胞增殖与凋亡的影响[J].实用癌症杂志,2020,35(05):728-731+739.