口腔正畸是通过对牙齿施加一定大小的力，引起牙齿移动，解除各种错颌畸形，改善颌面部功能和美观的治疗方法。临床上正畸患者可能存在体内激素水平变化或局部牙周组织炎症，当这些患者的牙齿受到正畸力的作用时，易导致牙周组织改建失衡，出现支抗丧失、牙齿移动过快伴随牙齿松动度过大等现象。目前研究[1]已明确正畸治疗中牙周组织的改建是骨形成和骨吸收两者偶联的动态平衡过程，可影响该平衡的因素（物理因素[2]、生物因素[3]和药物因素[4]等）均可能改变牙齿移动的效率，因此寻找一种安全、稳定且高效的方法来调控牙周组织改建是口腔正畸学领域的研究热点。免疫刺激性脱氧寡核苷酸（CpGODN）是一种人工合成的短脱氧核糖核酸单链分子。早期研究[5]表明：CpGODN可通过经典作用方式调控成骨-破骨平衡。研究[6,7]显示：特定序列的CpGODN可促进大鼠骨髓间充质干细胞和人牙周膜细胞增殖，且可上调经成骨诱导的骨髓间充质干细胞中Runt-相关转录因子2(Runt-relatedtranscriptionfactor2,Runx2）、Osterix和Ⅰ型胶原（collagenⅠ，ColⅠ）等成骨相关因子的表达，FENG等[8]通过体外研究筛选出CpGODNBW006具有促进大鼠成骨细胞增殖的作用，但其在体内环境中对牙周组织有何影响未见相关报道。HAN等[9]通过建立大鼠实验性牙移动模型证实机械刺激可通过上调Runx2和Osterix的表达调控牙周组织改建。基于以上研究，本研究在大鼠实验性牙移动模型中观察CpGODNBW006对牙移动距离、牙周组织中Runx2和Osterix表达的影响，初步探究其对正畸牙移动过程中成骨-破骨平衡的调控作用，为未来深入研究CpGODN如何调控牙周组织改建奠定基础。

1、材料与方法

1.1实验动物、主要试剂和仪器

7周龄Wistar雄性大鼠36只（吉林大学实验动物中心提供），动物合格证号：SCXK（辽）2015-0001，体质量（180±10)g。CpGODNBW006(5′-TCGACGT-TCGTCGTTCGTCGTTC-3′）由吉林大学基础医学院分子生物学实验室设计，大连TaKaRa公司合成；磷酸盐缓冲液（PBS）和苏木精-伊红（HE）染色剂（吉林大学口腔医学院免疫组织化学实验室配制）；柠檬酸钠抗原修复液（武汉博士德生物公司）；Runx2抗体和Osterix抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；即用型免疫组织化学超敏UltraSensitive TMSP试剂盒和DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）。RM2245石蜡切片机（徕卡公司，德国），IX71倒置荧光显微镜（Olympus公司，日本）。

1.2实验动物分组

36只Wistar大鼠每笼6只分笼饲养，自由饮水摄食，每12h昼夜交替，适应性饲养7d，每只大鼠左侧上颌为实验组（局部注射CpGODNBW006），右侧上颌为对照组（局部注射PBS）。

1.3实验性大鼠牙移动模型的建立

大鼠经10%水合氯醛（3mL·kg-1）腹腔注射麻醉，仰卧位固定于操作台，使用高速涡轮机装配细颗粒金刚砂车针在大鼠上颌切牙唇面和轴角近龈缘处及双侧上颌第一磨牙近中轴角近龈缘处做固位沟，深度约0.25mm，使用0.25mm的正畸不锈钢结扎丝将镍钛螺旋拉簧与大鼠上颌第一磨牙和切牙结扎，弹簧测力计调整拉簧力量为0.49N，以切牙作为支抗牙近中移动双侧第一磨牙（图1，见插页四），每24h检查加力装置，如发生脱落重新结扎。

1.4给药途径和方法

大鼠实验性牙移动模型建立后，于大鼠左侧上颌第一磨牙近中颊侧牙龈黏膜处局部注射CpGODNBW00640μL，浓度为25mg·L-1，并于右侧同名牙相同部位注射等量PBS溶液，每3d注射1次，直至实验结束。

1.5实验标本的制备

分别于加力3、7和14d时随机选取12只大鼠心脏灌流处死，分离含双侧上颌磨牙和牙槽骨的组织块，置于新配置的4%中性多聚甲醛固定液中常规固定24h，使用10%乙二胺四乙酸（EDTA）室温下脱钙12周，常规梯度脱水，石蜡包埋，沿第一磨牙近远中方向制备厚度为3～5μm的连续石蜡切片。分别进行HE染色和免疫组织化学染色。

1.6HE染色观察大鼠牙周组织形态表现

显微镜下选取牙周韧带完整的切片，常规经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，苏木精染色，盐酸酒精分化，伊红复染，脱水、透明，中性树胶封片，光镜下观察牙周组织形态表现，使用显微摄像系统（CMS800）进行图像采集，使用Image-ProPlus6.0图像分析软件测量加力7和14d时大鼠第一磨牙远中最凸点与第二磨牙近中最凸点间距离作为牙齿移动距离，单位为mm。

1.7免疫组织化学染色检测大鼠牙周组织中Runx2和Osterix阳性表达水平

使用Runx2抗体、Osterix抗体、免疫组织化学SP试剂盒和DAB显色试剂盒进行免疫组织化学染色，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，细胞或组织呈特异性棕黄色染色者为阳性表达信号。染色结果采用显微摄像系统进行图像采集，每张切片分别选取阳性表达区域在400倍镜下采集图像，使用Image-ProPlus6.0图像分析软件半定量分析Runx2和Osterix阳性表达区域的平均光密度（AOD）值，由同一实验者重复测量2次后取平均值，即为Runx2和Osterix阳性表达水平。

1.8统计学分析

采用SPSS23.0统计软件进行统计学分析。各组大鼠牙齿移动距离及Runx2、Osterix阳性表达水平符合正态分布，以表示，实验组与对照组组间比较采用两独立样本t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.12组大鼠牙周组织形态表现

压力侧：加力3d时对照组牙周膜间隙变窄，可见部分牙周韧带呈玻璃样变，大量破骨细胞分布于根尖区，尚未见明显骨吸收；实验组牙周膜未见明显变化。加力7d时对照组可见蚕蚀状骨吸收陷窝，牙槽骨明显吸收；实验组可见破骨细胞活动，出现骨吸收。加力14d时对照组和实验组牙周膜纤维基本恢复正常排列，骨吸收活动减弱。张力侧：加力3d时对照组牙周膜间隙增宽，可见牙周膜纤维排列紊乱；实验组牙周膜间隙未见明显改变，可见少量成骨细胞。加力7d时对照组牙周膜间隙进一步增宽，同时可见成骨细胞；实验组大量成骨细胞沿牙槽骨牙周膜交界处分布。见图2（插页五）。加力14d时对照组牙槽骨丰满度和高度均低于实验组。

2.22组大鼠牙齿移动距离

对照组和实验组大鼠牙齿移动距离随时间延长不断增加；与对照组比较，加力7和14d时实验组大鼠牙齿移动距离明显减少（P<0.01）。见表1和图3（插页五）。

表1不同时间2组大鼠牙齿移动距离

2.32组大鼠牙周组织中Runx2阳性表达水平

Runx2主要表达于大鼠牙周膜成纤维细胞、成牙骨质细胞和成骨细胞中，特异性棕黄色染色为阳性表达信号，阴性对照为蓝色。加力3d时实验组Runx2阳性表达水平高于对照组（P<0.05）；随着加力时间的延长，实验组Runx2阳性表达水平升高，7d时达到峰值，明显高于对照组（P<0.01);14d时实验组Runx2阳性表达水平有所下降，但仍明显高于对照组（P<0.05）。对照组牙周组织中Runx2阳性表达水平一直较低，3d时表达水平最高，随后逐渐下降。见表2和图4（插页五）。

表22组大鼠牙周组织中Runx2阳性表达水平

2.42组大鼠牙周组织中Osterix阳性表达水平

Osterix主要表达于牙龈成纤维细胞、牙周膜成纤维细胞、成骨细胞及骨细胞中，特异性棕黄色染色为阳性表达信号，阴性对照为蓝色。加力3d时实验组Osterix阳性表达水平明显高于对照组（P<0.01）；随着加力时间的延长，实验组和对照组Osterix阳性表达水平均呈现先升高后降低的趋势，7d时达到峰值，14d时有所下降，但实验组Osterix阳性表达水平明显高于对照组（P<0.01）。见表3和图5（插页五）。

表32组大鼠牙周组织中Osterix阳性表达水平

3、讨论

CpGODN是长度为20～30个碱基、含有数个CpG基序的脱氧寡核苷酸，CpG基序是以非甲基化CpG为核心，5′端有2个嘌呤、3′端有2个嘧啶的六核苷酸序列，如AACGTT等，CpG基序使ODN具有较强的免疫刺激活性[10]。目前，CpGODN对成骨细胞增殖分化的作用已经得到验证，FENG等[8]的研究表明：特定序列的CpGODN影响成骨细胞相关功能基因的转录表达，通过上调MG63细胞中Runx2和Osterix的表达促进成骨细胞增殖活化。CpGODNBW006是我国自行设计合成的一种线性全硫代修饰B型CpGODN，对B细胞有很强的免疫刺激活性，由于其本身无免疫原性[11]，不会诱发自身免疫反应，且多项体内研究[12,13]表明其安全性高，局部刺激性小，可通过多种途径给药，近年来被广泛应用于抗肿瘤、抗过敏、抗感染[14]及疫苗佐剂[11]的研究与开发。

正畸牙齿的移动是复杂而精细的生物机械过程，该过程主要依赖于牙周组织对持续性机械力的生物反应[15]，正畸力诱导神经递质、生长因子和细胞因子生成并通过生物力学信号转导通路传递至破骨细胞和成骨细胞，导致骨吸收和骨形成[16,17]。骨形成的分子机制主要涉及3个阶段：增殖、细胞外基质的成熟和矿化。早期骨改建相关研究[8]显示：CpGODNBW006可促进大鼠成骨细胞增殖。本实验通过建立大鼠实验性牙移动模型，采用局部注射CpGODNBW006的方法，初步探究其在体内环境下对正畸过程中牙周组织改建的调控作用。本研究结果显示：与对照组比较，实验组大鼠牙齿移动距离明显减小，牙槽骨高度及丰满度明显增加，说明CpGODNBW006抑制了实验组大鼠的牙槽骨吸收，导致正畸力作用下大鼠第一磨牙的近中移动减慢。为探讨其可能的机制，本研究进一步检测了大鼠牙周组织中Runx2和Osterix蛋白的表达。

Runx2是首个被发现的成骨细胞特异性转录因子，通过与启动子区域的成骨细胞特异顺式作用元件2(OSE2）结合激活一系列标志基因，如骨钙素（OCN）、碱性磷酸酶（ALP）、骨唾液蛋白（BSP）和骨桥蛋白（OPN）等[18,19]，启动骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[20]。早期研究[21]表明：牙周膜中的Runx2是力学信号的靶基因。本研究通过免疫组织化学染色方法检测了实验性牙移动模型大鼠牙周组织中Runx2的表达，结果显示：在正畸力作用下，大鼠牙周组织中Runx2主要表达于牙周膜成纤维细胞、成牙骨质细胞和成骨细胞，加力3d时局部注射PBS的对照组大鼠牙周组织中Runx2表达水平最高，随后其表达水平下降，这与QIN等[22]的研究结果一致；局部注射CpGODNBW006的实验组大鼠牙周组织中Runx2表达水平则在加力7d时达到峰值，考虑到有研究表明Runx2在前成骨细胞中表达上调，在未成熟成骨细胞中表达达到最高水平，在成熟的成骨细胞中表达下调，本文作者推测CpGODNBW006可能使更多的牙周膜干细胞向前成骨细胞分化且促进了前成骨细胞的增殖，一定程度上增加了加力7d时大鼠牙周组织中未成熟成骨细胞的数量；在14d实验期内，实验组大鼠牙周组织中Runx2表达水平虽先升高后降低，但始终明显高于对照组，说明CpGODNBW006可增强大鼠牙移动过程中牙周组织中Runx2的表达水平。

Osterix是2002年由NAKASHIMA等[23]发现的一种锌指转录因子，研究[24,25]表明：Osterix是成骨细胞生成、分化和骨组织发育重要的调控因子，通过激活一系列基因在前成骨细胞分化为成熟成骨细胞和骨细胞的过程中起重要作用。本研究结果显示：机械刺激使大鼠牙周组织中Osterix的表达水平先升高后降低，加力7d时达到最高值，该结果与HAN等[9]的动物实验研究结果相符。本研究中与对照组比较，实验组大鼠牙周组织中Osterix阳性表达水平明显升高，进一步说明局部注射CpGODNBW006也可上调牙移动过程中大鼠牙周组织中Osterix的表达。牙槽骨中成骨细胞的分化成熟是一个多步骤的复杂过程，牙周膜干细胞形成前成骨细胞的关键因子是Runx2，而Osterix是前成骨细胞分化为成熟成骨细胞的关键因子，且Osterix是Runx2的下游信号分子，受Runx2的调控[18]，在本研究中大鼠牙周组织中Runx2和Osterix阳性表达水平的变化证明其符合生物调控的规律。

CpGODNBW006的安全性是体内用药所必须考虑的。本研究中大鼠局部注射部位未观察到明显的黏膜变化，如水肿、发红或糜烂等，结合已有关于CpGODNBW006安全性的研究[13]，提示大鼠注射该剂量CpGODNBW006处于安全范围之内，但关于其局部注射的生物安全性尚待进一步验证。

本研究通过建立大鼠实验性牙移动模型，证实了CpGODNBW006可减少正畸力作用下大鼠牙齿的移动距离，初步阐明其可能途径是通过上调牙周组织中Runx2和Osterix的表达水平来调控牙周组织改建，但具体作用机制尚有待今后深入研究。本研究为深入探讨CpGODN调控牙周组织改建奠定了体内实验基础，局部注射CpGODNBW006有望成为调控牙周组织改建的新途径。

参考文献：

[7]秦雁雁,申玉芹,任春霞,等.不同序列CpGODN对牙周膜细胞的促增殖作用[J].吉林大学学报(医学版),2012,38(5):876-879.

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[19]沈晨曦,李米,李金源,等.全反式维A酸与骨形态发生蛋白联合应用对不同鼠源细胞骨钙素及成骨相关基因表达的影响[J].解放军医学杂志,2019,44(4):287-296.

黄蕾,刘宇妍,于文雯,周雪纯,张骁,申玉芹,郑义,孙新华.CpGODNBW006对实验性牙移动模型大鼠牙周组织中Runx2和Osterix表达的影响及其意义[J].吉林大学学报(医学版),2020,46(02):340-345+434-435.

基金:吉林省科技厅医药健康产业发展专项资金资助课题(20170311032YY);吉林省财政厅科研基金资助课题(jsz2018170-12)