肠道病毒(enterovirus,EVs)为小RNA病毒科肠道病毒属单正链RNA病毒,主要有脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)、埃可病毒(Echovirus)和新型肠道病毒EV68～EV71[1]。EVs通过肠道感染,但往往引起肠外疾病,如支气管炎和肺炎、手足口病、心肌炎、心包炎和脊髓灰质炎等,但以儿童呼吸道感染最为常见[1,2]。此外,EVs血清型众多,不同血清型地域分布及其所致疾病有明显差异[3,4,5,6]。众所周知,包括我国在内的不少国家和地区流行EV71和一些柯萨奇病毒血清型感染所致的手足口病,但近年来EVs引起的儿童呼吸道感染性疾病发病率不断升高,引起国内外广泛关注[7,8,9,10,11]。所有EVs具有衣壳蛋白VP1,但不同EVs及其血清型VP1序列可有明显差异,故VP1基因不仅用于EVs分类参考,也作为血清型分类依据[12]。本研究中,我们采用VP1基因通用引物的实时荧光定量RT-PCR检测了2 164例呼吸道感染患儿标本中EVs,阳性标本采用EVs VP1/VP3基因通用引物的套式RT-PCR扩增后测序分型,以了解本地区儿童呼吸道感染性疾病的优势EVs及其主要血清型和流行特征,为此类疾病临床诊治提供参考。

1、材料与方法

1.1一般临床资料

采集2016年1月至2018年12月杭州地区多家门诊或住院2 164例发热伴急性呼吸道感染症状患儿咽拭子标本,其中男性患儿1 297例、女性867例,患儿最大年龄13岁、最小34 d,中间年龄3岁。

1.2主要仪器与试剂

RNA病毒核酸提取试剂盒(湘长械备20150021)和EVs核酸检测试剂盒(国械注准20173400073)购自湖南圣湘生物科技有限公司。实时荧光定量PCR仪为美国ABI公司产的ABI-7500型。电泳仪和凝胶图像分析系统为美国Bio-Rad公司产品。

1.3方法

1.3.1病毒RNA提取

按照病毒核酸提取试剂盒的说明书,采集咽拭子置于标本保存液中,充分震荡混合后取200μL移入1.5 mL灭菌试管中,加入600μL提取液-1震荡混匀,瞬时离心后加入100μL提取液-2震荡混匀,室温静置30 min,瞬时离心后将试管置于分离器上,静置3 min后吸弃分离液,加入600μL提取液-3和200μL提取溶液-4震荡混匀,瞬时离心后将试管置于分离器上,静置3 min后吸弃分离液,加入30μL RNA洗脱液,混匀后室温静置5 min,将离心管置于分离器上静置3 min,吸取洗脱液即为病毒RNA提取物,置—70℃备用。

1.3.2实时荧光定量RT-PCR

按照EVs核酸检测试剂盒说明书,每管加入实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)反应液43μL、酶混合液2μL、病毒RNA模板5μL,然后在实时荧光定量PCR仪上检测。反应条件:95℃1 min、50℃30 min逆转录;95℃1 min,95℃15 s、60℃30 s,共45个循环进行扩增。

1.3.3 EVs分型

参照文献[13]合成EVs VP1/VP3区通用分型测序引物(表1)。qRT-PCR检测EVs核酸阳性标本进行套式PCR(Nested-PCR)扩增。采用通用引物224/222进行逆转录和第1次PCR扩增,反应参数:95℃1 min、50℃30 min逆转录;95℃5 min,95℃15 s、55℃45 s、72℃30 s,共45个循环进行扩增。以5μL第1次PCR产物为模板,采用通用引物AN89/AN88进行第2次PCR扩增,反应参数:95℃1 min,95℃15 s、55℃45 s、72℃30 s,共30个循环进行扩增。用溴乙锭预染色1.5%琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物,委托泰和永昌(长沙)生物技术有限公司采用双脱氧末端终止法测序。测序结果在GenBank数据库中的序列进行Blast比对,获得EVs种类及其分型结果。

表1 EVs套式PCR扩增引物

1.3.3 EVs基因种系发生分析

参照文献选择GenBank中代表性参考序列[13],上述EVs VP1/VP3区测序并EVs种类及其分型结果的每条序列采用ClustalW-2.1软件默认参数进行多序列比对,采用Mega 6.0软件和Neighbar-Joining法构建种系发生进化树并分析。

1.3.4不同年龄和性别儿童易感性分析

qRT-PCR检测EVs核酸阳性以及套式PCR和测序后病毒分型的患儿进行不同性别和年龄对EVs及其主要血清型易感性分析,其中不同患儿年龄分为<1、1～、2～、3～、4～和≥5岁共6组。

1.3.5统计学分析

采用SPSS 19.0软件中χ2检验对不同EVs及其血清型检测阳性率、不同年龄与性别患儿对EVs及其血清型感染率进行比较与分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结 果

2.1 EVs检测阳性率与分型结果

2 164例发热伴急性呼吸道感染症状患儿咽拭子标本中,23.5%(508/2 164)的标本EVs RNA检测结果阳性。508例EVs RNA阳性标本中,57.1%(290/508)成功扩增后分型(图1和表2),其余218例(42.9%)因病毒RNA浓度太低未能扩增分型。290例EVs分型的标本中,柯萨奇病毒A组(CoxA)和B组(CoxB)分别有218例(75.2%)和34例(11.7%)、EV71有26例(8.9%)、埃可病毒(Echo)有12例(4.1%),柯萨奇病毒(86.9%,252/290)是引起儿童呼吸道感染的优势EVs种类(χ2=330.70,P<0.05),尤其是CoxA检出率高于CoxB、EV71和埃可病毒(χ2=243.22、260.80、305.75,P<0.05)。218例CoxA阳性标本中,CoxA6(39.5%,86/218)和CoxA10(33.0%,72/218)检出率高于CoxA16(14.7%,32/218)、CoxA4(8.3%,18/218)和CoxA2(4.6%,10/218)(χ2=33.88、20.20,P<0.05)。

图1通用引物和套式PCR扩增的EVs基因片段

表2 290例呼吸道感染患儿的EVs分型结果                         

2.2检出的EVs血清型进化树分析结果

与GenBank中相应代表性参考序列比较[13],CoxA2、CoxA4、CoxA6、CoxA10、CoxA16、CoxB1、CoxB5、Ech11和Echo30序列同源性较高,为90.1%～99.8%;EV71序列有一定差异,同源性为85.7%～99.7%;提示所采用的VP1/VP3基因测序分型法能有效鉴定EVs阳性标本中的病毒型别(图2)。

图2检出的EVs系统进化树

2.3不同EVs所致疾病种类

柯萨奇病毒和埃可病毒通常引起各种肠外感染,EV71主要引起手足口病、疱疹性咽峡炎以及少数儿童脑炎、脑膜炎,但也可引起呼吸道感染,脊髓灰质炎病毒主要引起脊髓灰质炎[1,14,15,16,17]。290例经EVs分型的发热伴急性呼吸道症状患儿中,205例诊断为鼻咽喉、扁桃体和口腔等上呼吸道感染,27例为下呼吸道感染性疾病,58例为伴有呼吸道症状的手足口病、脑炎和膜脑炎、高热惊厥,详见表3。232例确诊的呼吸道感染疾病患儿中,可检出柯萨奇病毒、埃可病毒和EV71,但CoxA占77.2%(179/232)(χ2=68.4,P<0.05),其中CoxA6(30.6%,71/232)和CoxA10(25.9%,60/232)为优势柯萨奇病毒血清型(χ2=54.1、34.9,P<0.05)。

2.4不同性别儿童对EVs及其血清型易感性

508例qRT-PCR检出EVs感染的发热伴急性呼吸道感染症状患儿中,63.0%(320/508)为男童,37.0%(188/508)为女童,男童较女童易感(χ2=68.60,P<0.05)。在感染主要的EVs(CoxA6、CoxA10、CoxA16和EV71)患儿中,男童较女童易感CoxA6(χ2=11.25,P<0.05)、女性较男性儿童易感CoxA10(χ2=4.00,P<0.05),但不同性别儿童对CoxA16和EV71感染率差异无统计学意义(χ2=1.00、2.77,P均>0.05)(表4)。

表3不同EVs感染所致疾病种类

表4不同性别患儿对不同EVs及其血清型易感性

2.5不同年龄儿童对EVs及其血清型易感性

508例qRT-PCR检出EVs感染的发热伴急性呼吸道感染症状患儿中,1岁儿童最易感(χ2=13.15,P<0.05),其次是2岁儿童(χ2=9.20,P<0.05)和3岁儿童(χ2=4.96,P<0.05),<1岁、4岁和≥5岁儿童感染率差异无统计学意义(P>0.05)(表5)。在感染主要EVs(CoxA6、CoxA10、CoxA16和EV71)的患儿中,1岁和2岁儿童对CoxA6和CoxA10易感(χ2=5.79、7.15、9.25,P<0.05),但不同年龄儿童对CoxA16和EV71的感染率差异无统计学意义(χ2=2.74、2.36,P均>0.05)(表5)。

表5不同年龄患儿对EVs及其血清型易感性

3、讨 论

近年来,EVs引起的呼吸道感染性疾病发病率逐年升高,尤其是儿童夏季呼吸道感染,EVs是主要病原体之一[2,9,10]。此外,不同国家或地区引起呼吸道感染的优势EVs种类及其血清型差异较大。例如,2008年中国台北地区CoxA2引起的儿童急性呼吸道感染暴发流行[18];2012年泰国发生CoxA8引起的儿童急性呼吸道感染大规模暴发流行[4];2014年巴西暴发了CoxA9为主的儿童急性呼吸道感染[19];2010年芬兰和2014—2015年美国暴发了EV68引起的严重儿童呼吸道感染[20,21]。然而,近年来仅北京、上海、深圳和本省湖州地区开展了儿童呼吸道感染性疾病中优势EVs及其血清型的流行病学研究[11,22,23,24,25],但国内其他地区无相关研究报道。

引起呼吸道感染的病原微生物种类繁多,一些细菌(包括支原体和衣原体)、病毒和真菌均可成为人呼吸道感染的病原体。引起儿童呼吸道感染的病毒除EVs外,还有流感和副流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、冠状病毒和腺病毒等[1]。本次2 164例发热伴急性呼吸道感染症状患儿咽拭子标本中,有23.5%(508/2 164)的标本EVs RNA检测结果阳性,提示EVs可能是当前儿童呼吸道感染的重要病原体,值得引起重视。

EVs种类及其血清型众多,除脊髓灰质炎病毒有3个血清型外,柯萨奇病毒分A组和B组(CoxA和CoxB),CoxA有23个血清型、CoxB有6个血清型,埃可病毒有31个血清型,其中柯萨奇病毒和埃可病毒所致疾病谱广泛,可引起心肌、神经、呼吸、消化系统和全身感染,EV68～71中目前仅肯定EV68和EV71可引起呼吸道感染[1,14,15,16]。尽管在136例明确诊断为呼吸道感染的患儿咽拭子标本中检出了柯萨奇病毒、埃可病毒和EV71,但CoxA占77.9%(106/136)(P<0.05),在检出的5个CoxA血清型中,CoxA6(23.5%)和CoxA10(22.1%)为优势血清型(P<0.05)。国内文献报道,深圳地区引起儿童呼吸道感染的优势EVs主要是CoxA6、其次是CoxA16;邻近的上海市主要是CoxA2、CoxA5和CoxB5;上海市松江地区主要是CoxB3、其次是CoxA4;本省湖州地区主要是CoxA6、其次是CoxA2[11,22,23,24,25]。上述资料表明,引起儿童呼吸道感染的主要EVs为CoxA,但不同地区优势CoxA血清型存在很大差异。

了解病原微生物流行特征及其易感人群,对于相关疾病的有效防控具有重要意义。我们的实验结果显示,508例EVs检测阳性发热伴呼吸道症状患儿中,男童较女童易感(P<0.05),主要感染的病原体CoxA6、CoxA10、CoxA16和EV71中,男童易感CoxA6、女童易感CoxA10(P<0.05),1岁儿童最易感、其次是2和3岁儿童(P<0.05),<1岁儿童易感性较低可能与来自母体过继免疫力、≥4岁儿童自身免疫系统开始发育成熟有关[26]。然而,我们的检测与分析结果显示,不同性别和年龄儿童对CoxA16和EV71感染率差异无统计学意义(P>0.05)。国内文献报道,深圳地区EVs呼吸道感染儿童易感年龄为2岁以下;上海市松江地区和本省湖州地区易感年龄分别为6个月～6岁和3岁以下;北京地区和上海市资料中未分析易感年龄[11,24,25]。综上所述,由于不同国家或同一国家不同地区引起呼吸道感染的优势EVs种类及其血清型差异较大,了解本地区引起呼吸道感染的优势EVs种类及其血清型,对防控和临床诊治此类疾病具有重要意义。

利益冲突:无

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基金:杭州市科技计划引导项目(No.20181228Y86);杭州市萧山区科技计划项目(No.2017216)联合资助