中性粒细胞是宿主应对外来入侵的重要防线[1]。中性粒细胞可通过吞噬、脱颗粒以及产生大量活性氧来清除病原体[2]。近来发现，中性粒细胞可通过释放自身核酸为骨架并锚定大量抗菌蛋白至胞外生成胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps,NETs），并介导机体对病原体的捕获和清除作用[3,4,5]。然而过度的NETs生成参与了多种自身免疫疾病的病理过程[6,7]。脂多糖/内毒素（lipopolysaccharide/endotoxin,LPS）是导致脓毒症发生的主要病原体[8]。研究表明脓毒症时LPS可诱导中性粒细胞产生NETs[9]。NETs多种组分会诱导血管内凝血反应，最终导致弥散性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation,DIC)[10,11,12]。因此，研究脓毒症时NETs过度生成的发生机制对寻找有效的干预措施具有重要意义。

白蛋白是血清中的主要蛋白成分，在维持机体营养和渗透压过程中具有重要作用[13]。最新研究表明，白蛋白不足或活性缺失可能与NETs的生成密切相关[14]。但白蛋白对于LPS诱导NETs释放的调控作用和可能机制尚不清楚。对其深入研究，有助于阐明脓毒症时NETs生成以及凝血功能障碍的具体机制和为临床治疗脓毒症提供新的思路。因此，本研究首先在明确白蛋白抑制LPS诱导NETs生成的基础上，进一步研究钙离子和自噬在介导白蛋白抑制LPS诱导NETs的关系，最终阐明白蛋白抑制LPS诱导NETs生成的分子机制。

1、材料与方法

1.1实验材料

人中性粒细胞分离试剂盒购于天津灏洋公司。Sytox Green、Fluo-4 AM购于Invitrogen公司；LPS、EGTA、3-MA和雷帕霉素（Rapamycin）购于Sigma公司；胎牛血清购于Serabest公司；人、牛血清白蛋白均购于索莱宝生物科技有限公司，人血清白蛋白纯度99%(agarose gel electrophoresis)，牛血清白蛋白纯度97%；鼠、马血清白蛋白均购于EquitechBio公司，纯度均大于96%；抗LC3B、髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）、弹性蛋白酶（neutrophil elastase,NE）和瓜氨酸化组蛋白H3(citrullinated histone H3,Cit-H3）抗体购于Abcam公司；Cy3标记的荧光二抗购于Cell Signaling Technology）公司；A23187购于Selleck公司；DAPI购于碧云天公司。

1.2人外周血中性粒细胞分离与培养

取4 ml中性粒细胞分离液于玻璃离心管，每管缓慢加入柠檬酸盐抗凝的健康志愿者外周静脉血4 ml,20℃，800 g离心20 min。离心后吸取下层中性粒细胞层至另一无菌离心管中，10 ml清洗液，充分混匀，20℃，360 g离心5 min，弃上清，加入5 ml红细胞裂解液，混匀后裂解5 min。加入10 ml清洗液，20℃，220 g离心5 min。弃上清，加DMEM培养基重悬细胞，37℃，5%CO2培养待用。

1.3 NETs检测

用培养基调整中性粒细胞数为1×106/ml接种于玻璃培养皿中。加入不同质量浓度的LPS或其余试剂作用一定时间。加入Sytox Green(1µmol/L）对释放出胞外的NETs核酸骨架进行染色，使用共聚焦显微镜在激发光488 nm，发射光520 nm的条件下随机采集荧光图片，使用ZEN 2012软件对所得图像进行定性分析。同时将中性粒细胞（1×106/ml）接种于24孔板中。加入LPS或其余试剂处理后，加入核酸酶S7作用10 min，吸取上清，300 g离心10 min。取200µl上清，加入Sytox Green(1µmol/L）染色，使用多功能读数仪器检测荧光强度（n=3）。

1.4免疫荧光检测

使用640 ng/ml LPS刺激含1%FBS培养基培养的中性粒细胞3 h，弃上清，加入4%多聚甲醛固定20 min。弃上清，PBS洗涤3遍。使用Cit-H3,MPO,NE一抗4℃孵育过夜。弃培养基，PBS洗3遍。加入Cy3标记二抗，室温孵育1 h。PBS洗3遍。加入Sytox Green(1µmol/L）染色，共聚焦显微镜检测NETs与蛋白的共定位情况。

1.5胞内钙离子检测

LPS单独或联合BSA刺激中性粒细胞2 h，加入钙离子探针Fluo-4 AM(2.5µmol/L),37℃孵育20 min,PBS洗2遍，共聚焦显微镜检绿色荧光信号，通过平均荧光强度定量胞内钙离子水平（n=3）。

1.6统计学分析

本实验至少重复3次，采用Graphpad Prism7.0统计软件分析数据，实验结果以均数±标准差表示。采用t检验进行2组间比较，采用One-way ANOVA方法进行多组间数据比较。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1低血清条件下LPS可诱导中性粒细胞释放NETs

使用不同质量浓度（160～640 ng/ml）的LPS在含1%或10%FBS的培养基中刺激中性粒细胞3 h，共聚焦显微镜检测NETs生成。结果显示，在1%FBS条件下，LPS在低剂量即可诱导大量NETs生成，在10%FBS条件下，LPS即使在高剂量仅可诱导微弱的NETs生成（图1a）。定量分析结果显示，LPS对NETs生成的诱导作用具有显著量效关系（图1b）。在1%FBS和640 ng/ml LPS的条件下，我们进一步观察了NETs生成的时效关系以及组成成分特点。结果显示，在低血清环境中，LPS在刺激1 h即可诱导NETs显著释放，且随时间延长NETs生成量逐渐增多（图1c,1d）。免疫荧光共定位实验结果显示，LPS诱导释放的胞外NETs结果中，可检测到髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）、弹性蛋白酶（neutrophil elastase,NE）、瓜氨酸化组蛋白（citrullinated histone H3,Cit-H3）等公认非核酸组分的分布，进一步证实NETs的生成（图1e）。

2.2白蛋白对LPS诱导中性粒细胞生成NETs具有抑制作用

图1 LPS可诱导中性粒细胞产生NETs（×20)

基于低血清浓度条件更易于LPS刺激中性粒细胞产生NETs，而白蛋白是血清的主要成分并具有重要的生理功能，因此我们推测白蛋白可能是重要的抑制因子。为此我们进一步检测了白蛋白对LPS诱导中性粒细胞生成NETs的影响。在1%FBS条件下使用640 ng/ml LPS刺激中性粒细胞，同时给予不同浓度的牛血清白蛋白（BSA），共聚焦检测NETs生成，结果显示，随着BSA浓度增加，LPS诱导的NETs生成明显减少，BSA达到4 mg/ml时NETs基本不可检测（图2a），定量分析结果显示，BSA对NETs具有显著的抑制作用，且量效明确（P<0.01，图2b）。为了验证不同白蛋白对NETs的抑制作用是否在种属间高度保守，我们分别采用4 mg/ml的人、小鼠和马血清白蛋白替代BSA进行干预，共聚焦结果显示，人、小鼠和马的血清白蛋白均可以显著抑制LPS诱导的NETs生成，其效果与BSA相当（P<0.01，图2c,2d）。表明白蛋白具有高度保守的抑制LPS诱导中性粒细胞生成NETs的活性。

2.3白蛋白通过降低胞浆Ca2+进而抑制LPS诱导的NETs生成

文献报道Ca2+可能介导了NETs的生成[15]。因此我们进一步研究白蛋白抑制NETs生成的作用是否与Ca2+有关。我们首先检测了BSA对LPS诱导中性粒细胞胞内钙离子水平的影响。使用钙离子探针Fluo-4 AM对胞内钙离子进行标记，共聚焦显微镜检测荧光信号。结果显示，LPS可诱导中性粒细胞胞内Ca2+水平增加，使用4 mg/ml BSA干预后可显著降低胞内Ca2+水平（P<0.01，图3a）。我们进一步使用钙离子螯合剂EGTA(5 mmol/L）和钙离子载体A23187(1µmol/L）改变中性粒细胞胞内Ca2+水平，共聚焦观察对LPS诱导NETs生成的影响。结果显示，EGTA可降低LPS诱导的NETs生成，相反A23187可进一步增强LPS诱导的NETs生成（图3b）。定量结果显示，EGTA对NETs的抑制效果与A23187的增强效果均较单独LPS组具有显著差异（P<0.01，图3c）。表明胞浆Ca2+可能参与介导了白蛋白对LPS刺激NETs生成的抑制作用。

图2白蛋白可抑制LPS诱导中性粒细胞生成NETs（×20)

图3 Ca2+介导白蛋白对NETs生成的抑制作用（×20)

2.4白蛋白通过阻断Ca2+依赖性的细胞自噬介导对LPS诱导NETs生成的抑制作用

自噬在NETs生成过程中具有重要作用[16,17,18]。因此我们进一步研究了白蛋白通过调节Ca2+进而抑制NETs生成的作用是否与其调节自噬有关。我们首先利用激光共聚焦显微镜检测了BSA对中性粒细胞自噬蛋白LC3B的影响。结果显示，LPS可诱导LC3B的表达增加，提示其可上调细胞自噬水平。添加4 mg/ml的BSA可显著抑制LPS对自噬的上调作用（P<0.01，图4b）。我们进一步检测了Ca2+对自噬的影响。给予钙离子载体A23187可进一步增加自噬水平，相反钙离子螯合剂EGTA则可显著降低胞内自噬水平（P<0.05，图4a）。为验证BSA经Ca2+途径对自噬的调节是否与其抑制NETs生成的作用有关，我们使用自噬抑制剂3-MA(5 mmol/L）和激动剂雷帕霉素（Rapamycin,100 nmol/L）与BSA(2 mg/ml）联合处理LPS刺激的中性粒细胞。结果显示，与BSA单独处理组比，Rapamycin联合BSA使用可增强NETs的生成。反之，3-MA联合作用后可导致NETs水平的进一步降低（图4c）。NETs定量结果显示，Rapamycizn的增强作用与3-MA的抑制作用均具有显著差异（P<0.01，图4d）。表明白蛋白可能通过阻断Ca2+依赖性的细胞自噬介导对LPS诱导NETs生成的抑制作用。

图4钙离子和自噬调控白蛋白抑制NETs生成的作用（×20)

3、讨论

脓毒症是指感染和/或感染因素引起的宿主反应失调进而导致危及生命的器官功能障碍[19]。近年来发现NETs参与脓毒症凝血激活及血栓形成[10,12]，与脓毒症的凝血功能障碍甚至脓毒症病人的预后密切相关[8]。因此，基于NETs的生成机制研究治疗脓毒症的药物具有重要意义。

LPS是导致脓毒症的主要和重要病原分子之一，本研究发现LPS在体外可以诱导中性粒细胞生成NETs，特别是在血清浓度较低时可诱导NETs大量生成，提示血清中存在可以抑制NETs生成的某种物质。

白蛋白是血清的主要蛋白成分，具有许多重要的生理功能。有研究发现，降低血浆白蛋白浓度可显著增加脓毒症动物的死亡率；在脓毒症早期预防性给予白蛋白可以改善脓毒症病人的器官功能，提高其存活率[20,21]。在本研究中，我们发现白蛋白可有效抑制LPS诱导的NETs生成，且具有量效关系，结合文献[20,21]，我们认为白蛋白可通过抑制脓毒症时NETs的过度生成、减轻脓毒症病情，从而提高脓毒症病人的存活率。

对白蛋白抑制LPS诱导NETs生成的机制研究发现，增加钙离子浓度可增强LPS诱导的NETs生成，而钙离子螯合剂可有效抑制NETs的生成，表明钙离子参与LPS诱导的NETs生成。白蛋白可抑制LPS刺激的中性粒细胞中钙离子水平的升高，并抑制NETs的生成,提示白蛋白抑制NETs生成的机制可能与抑制钙离子内流有关。

大量研究已经表明，钙离子与自噬密切相关[22]，而自噬参与NETs的调控[23]。在本研究中，我们发现，增加细胞内钙离子浓度可进一步增强LPS诱导的自噬，钙离子螯合剂则可抑制LPS诱导的自噬，而白蛋白也可显著抑制LPS诱导的中性粒细胞胞内自噬水平。因此，我们认为，白蛋白抑制NETs生成的作用与其降低中性粒细胞中钙离子水平，进而抑制自噬密切相关。采用自噬抑制剂和自噬激动剂获得的结果则证实了我们的上述推测，即抑制自噬则NETs的生成受到抑制，增强自噬则NETs的生成增强。

综上所述，本研究发现，在高血清状态下中性粒细胞生成NETs能力降低，血清中白蛋白具有抑制NETs生成的作用，其作用机制与白蛋白降低中性粒细胞中钙离子水平、进而抑制自噬密切相关，为脓毒症的治疗提供了新的研究思路。

参考文献：

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[22]吴嘉麒,刘鑫,王宁,等.抑制内质网钙离子释放在诱导巨噬细胞自噬及逆转LPS耐受中的作用[J].免疫学杂志,2020,36(1):11-16.

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基金:陆军军医大学第一附属医院青年科技创新项目(SWH2018QNKJ-05)