骨肉瘤是一种起源于间叶组织的恶性肿瘤，好发于儿童和青少年，具有高度侵袭性和早期全身转移的特征[1]。近年来，随着外科手术、放疗、化疗和免疫、基因及分子靶向等治疗手段的开展，骨肉瘤患者的5年生存率逐步提高，但是药物的不良反应和患者生存率并未得到显著改善[2]。目前，用于治疗骨肉瘤的药物（如顺铂、多柔比星、甲氨蝶呤和异环磷酰胺）不仅使许多患者出现贫血、出血、听力损伤、肝肾功能衰竭等诸多毒性反应，还容易产生药物耐受[3]。因此，研发新的不良反应小、安全有效的药物对骨肉瘤治疗具有重要的作用。土木香内酯（alantolactone,ALT）为倍半萜烯内酯类化合物，广泛存在于菊科属植物中，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤及保肝降糖等多种生物学作用[4,5,6]。研究[7,8,9,10,11,12]表明，ALT对多种肿瘤如结肠癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌及白血病等均具有明显的抑制作用。然而，有关ALT对骨肉瘤作用的研究鲜见报道。本研究通过研究ALT对骨肉瘤143B细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响及其作用机制，旨在为临床更加安全有效的应用ALT治疗骨肉瘤提供实验依据。

1、材料与方法

1.1细胞系及主要试剂

人骨肉瘤143B细胞由重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室保存。

DMEM高糖培养液和胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）购自美国HyClone公司，链霉素和青霉素购自美国Gibco公司，ALT购自成都瑞芬思生物科技有限公司（纯度为98.06%，批号：T-023-181216），结晶紫染色液、Hoechst 33258染色液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、蛋白提取试剂盒及Wetern blotting(WB）检测试剂购自上海碧云天生物技术有限公司，MTT试剂购自美国Sigma公司，PVDF膜、化学发光试剂盒、基质胶和Transwell小室购自美国Millipore公司，荧光素酶报告质粒（Top-luc）由美国芝加哥大学何通川教授惠赠，荧光素酶分析试剂盒购自美国New England Biolabs公司，TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒及PCR相关试剂均购自日本TaKaRa公司，PCR引物由金斯瑞生物科技有限公司合成，鼠抗人β-actin单隆抗体购自南京钟鼎生物技术有限公司，兔抗人上皮钙黏蛋白（E-cadherin）、神经钙黏蛋白（N-cadherin）、cleaved caspase-3(c-caspase-3）、caspase-3、人多聚ADP核糖聚合酶（human poly ADP ribose polymerase,PARP）、cleaved PARP(c-PARP）以及基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinase-7,MMP-7）、β-catenin和c-Myc单克隆抗体均购自美国CST公司，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司，ECL试剂盒购自美国Millipore公司。

1.2细胞培养

骨肉瘤143B细胞在含有10%FBS、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM高糖培养液中置于37‧、5%CO2的恒温培养箱中培养，每隔2～3 d用0.3%胰酶进行消化和传代，待细胞处于对数生长期时用于后续实验。

1.3结晶紫染色法检测ALT对143B细胞存活率的影响

将长势良好的143B细胞以3×104个/孔的密度接种在24孔板中，孵箱培养12 h后用不同浓度（0、4、6、8、10µmol/L）的ALT处理，同时设置DMSO（终体积分数为0.03%）处理的细胞作为对照组，每组设3个复孔。待ALT作用24、48和72 h后，吸弃培养基，用PBS洗涤2遍，加入4%多聚甲醛溶液固定20 min，弃去溶液；避光加入结晶紫染液染色10 min，最后冲洗除去残余的结晶紫染液，干燥后在扫描仪下成像。成像完成后，用20%乙酸溶液充分溶解，在酶联免疫检测仪波长590 nm处检测各孔的光密度（D）值，计算细胞存活率。细胞存活率=（对照组D值-处理组D值）/对照组D值×100%。

1.4 MTT实验检测ALT对143B细胞增殖的影响

收集143B细胞，以500个/孔的密度接种于96孔板中，细胞培养12 h后，用不同浓度的ALT处理，调零组不加细胞而加入等体积的细胞培养液，另设DMSO（终体积分数为0.03%）作为对照组，每组设4个复孔。24、48和72 h后，每孔加入20μl MTT溶液（5 mg/ml），继续孵育4 h后弃上清液，加入150μl DMSO，振荡器避光振荡10 min使结晶充分溶解；用酶标仪于492 nm波长处测定D值，计算细胞增殖率。ALT处理组细胞增殖率=（各浓度处理组D值-调零组D值）/（0μmol/L处理组D值-调零组D值）×100%；对照组细胞增殖率=（对照组D值-调零组D值）/（0μmol/L处理组D值-调零组D值）×100%。

1.5划痕愈合实验检测ALT对143B细胞迁移的影响

当143B细胞汇合度达80%～90%时，用胰酶消化并重悬至单个细胞，以每孔1×105个细胞接种于6孔板，培养至细胞贴壁长满后，用200µl移液器枪头沿着6孔板直径在细胞培养板上垂直划痕，PBS冲洗3次后，加入2 ml不含FBS的DMEM培养液，用不同浓度的ALT处理0、9和18 h，记录不同时间点每组细胞同一位置的划痕区域，用Image J软件计算划痕区域的面积变化。划痕愈合率=（0 h划痕面积-18 h划痕面积）/0 h划痕面积×100%。

1.6 Transwell小室法检测ALT对143B细胞侵袭的影响

Transwell小室中加入30μl稀释10倍的基质胶，放入37‧孵箱待胶均匀凝固。后加入300μl含有2.5×104个143B细胞的DMEM，使用不同浓度的ALT处理，另设DMSO（终体积分数为0.03%）作为对照组，将小室放进含500μl 10%FBS的24孔板中培养24 h，用棉签擦拭上层膜表面的非侵入细胞。下层侵入细胞用4%多聚甲醛固定后，10%结晶紫染色10min。显微镜下拍照，每组随机选取膜的3个独立区域（×100）计数侵袭细胞数（用ImageJ软件统计穿膜细胞数并计算平均值）。

1.7 Hoechst33258染色法检测ALT对143B细胞凋亡的影响

将143B细胞接种于24孔板中（2.5×104个/孔）培养12 h后，用不同浓度的ALT处理，另设DMSO（终体积分数为0.03%）作为对照组，每组设置3个复孔。细胞培养24 h后，加入4%多聚甲醛溶液固定细胞10 min；用PBS洗涤2遍，加入200μl/孔Hoechst33258染色液（用PBS稀释，体积稀释比例为1∶100），室温放置3～5 min；吸除Hoechst33258染色液，PBS洗涤3次，每次5 min；在荧光显微镜下观察并拍照。当细胞凋亡时，细胞核呈亮蓝色荧光和浓缩的碎裂核。每组随机观察3个视野（×100），计数凋亡细胞数，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=视野中的凋亡细胞数/视野中的总细胞数×100%。

1.8荧光素酶报告基因实验验证Wnt信号通路的活性

将长势良好的143B细胞接种于T25培养瓶中，当细胞汇合度达60%～70%时，将T25中的培养基换成DMEM培养液，加入转染体系：5μl转染试剂Lipofectamine2000+3μg质粒+200μl DMEM培养液，4 h后再换成5 ml的10%FBS。待T25长满后，胰酶消化细胞铺至24孔板中，待细胞贴壁后按不同浓度（0、4、6、8、10μmol/L）的ALT处理，另设DMSO（终体积分数为0.03%）作为对照组，每组设置3个复孔。细胞培养12 h后，吸取每孔上清10μl用于测定荧光素酶活性（具体实验体系参考说明书），以此反映Wnt/β-catenin信号通路的活性。

1.9 qPCR法检测ALT对143B细胞中凋亡和Wnt信号通路相关基因mRNA表达的影响

用不同浓度的ALT处理143B细胞，另设DMSO（终体积分数为0.03%）作为对照组，培养48 h，收集细胞，用TRIzol试剂提取各组细胞的总RNA，并逆转录为cDNA；应用qPCR法扩增E-cadherin、N-cadherin、caspase-3、PARP以及Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin和下游靶分子MMP-7、c-Myc mRNA表达水平，引物序列见表1。反应条件：95‧变性5 s、55‧退火30 s、72‧延伸30 s，共40个循环。β-actin为内参照，以2-ΔΔCt值表示目的基因mRNA的相对表达水平。

表1 PCR引物序列

1.1 0 WB检测ALT对143B细胞中凋亡和Wnt信号通路相关蛋白表达的影响

用不同浓度的ALT处理143B细胞，另设DMSO（终体积分数为0.03%）作为对照组，培养36 h，用预冷的PBS冲洗3次后加入蛋白裂解液裂解细胞，抽取总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，另加入蛋白上样缓冲液后，于沸水中水浴处理10 min使蛋白变性。取35μg蛋白，进行10%SDS-PAGE、转PVDF膜，用5%牛血清白蛋白的封闭3 h，于4‧下加入CST一抗（均以1∶1 000稀释）12～16 h，用TBST洗膜3次（10 min/次）；后加入HRP标记的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG二抗（1∶5 000）于37‧孵育1 h，再用TBST洗膜3次（10 min/次）；用ECL试剂显影。采用Image J图像分析软件测定各目的蛋白条带的灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参照蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。

1.1 1统计学处理

上述各项实验均独立重复3次。应用SPSS 22.0软件和GraphPad Prism 5软件对实验数据进行统计分析和作图。正态分布的计量资料以表示，两组间比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析（组内两两比较采用LSD-t检验）。以P<0.05或P<0.01表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 ALT明显抑制143B细胞的增殖

经ALT(0、4、6、8和10μmol/L）处理143B细胞后，结晶紫染色结果（图1A）显示，与对照组相比，ALT可抑制143B细胞的增殖（均P<0.01）。MTT实验结果（图1B）显示，8和10μmol/L的ALT处理可明显抑制143B细胞的增殖活力（P<0.05或P<0.01）。结果表明，ALT可显著抑制人骨肉瘤143B细胞的增殖。

图1 ALT对143B细胞增殖的影响

2.2 ALT显著抑制143B细胞的迁移和侵袭

经0、4、8和10µmol/L的ATL处理143B细胞后，划痕愈合实验结果（图2A）显示，培养18 h后，对照组划痕愈合率高达（84.25±7.36）%，而10μmol/L的ALT处理组的细胞划痕愈合率为（17.83±5.96）%，表明ALT能显著抑制143B的迁移（P<0.01）。Transwell实验结果（图2B）显示，8和10µmol/L的ALT处理后，穿膜细胞数量明显减少（P<0.05或P<0.01），说明ALT能抑制143B细胞的侵袭。qPCR和WB实验结果（图2C、D）显示，ALT显著升高143B细胞中E-cadherin mRNA和蛋白表达水平的同时，降低N-cadherin的表达水平（P<0.05或P<0.01）。实验结果表明，ALT可抑制人骨肉瘤143B细胞的迁移和侵袭。

2.3 ALT促进143B细胞的凋亡

用不同浓度的ALT(0、4、8和10µmol/L）处理后，Hoechst33258染色法检测结果（图3A）显示，与对照组相比，ALT处理组143B细胞中出现细胞核高亮、核固缩、核碎裂以及染色质凝集现象的细胞数量明显增多（P<0.05或P<0.01);WB实验结果（图3B）显示，ALT处理组细胞中凋亡相关分子c-caspase-3、PARP和c-PARP蛋白的表达水平均显著升高（均P<0.01);q PCR检测结果（图3C）显示，ALT处理组细胞中PARP mRNA水平上调（P<0.05），而caspase-3则无明显变化（P>0.05）。实验结果表明，ALT可促进人骨肉瘤143B细胞的凋亡。

2.4 ALT抑制143B细胞中Wnt/β-catenin信号通路的活性

经8和10µmol/L)ALT处理后，荧光素酶报告基因实验结果（图4A）显示，与对照组相比，143B细胞T细胞淋巴因子或淋巴增强因子（T cell lymphocyte factor/lymphoid enhancer factor,TCF/LEF）的转录活性明显下降（P<0.05或P<0.01);qPCR检测结果（图4B）显示，细胞中β-catenin、MMP-7、c-Myc mRNA表达水平均有不同程度的下调（P<0.05或P<0.01）。WB检测结果（图4C）显示，细胞中β-catenin及下游靶分子MMP-7、c-Myc蛋白表达水平均明显降低（均P<0.01）。结果表明，ALT可抑制人骨肉瘤143B细胞中Wnt/β-catenin信号通路的活性。

3、讨论

骨肉瘤是一种恶性程度高、侵袭能力强、易发生肺转移的骨肿瘤。近年来，随着治疗手段不断改进，在一定程度上提高了骨肉瘤患者的5年生存率，但目前各种化疗药物（如顺铂、甲氨蝶呤）存在毒副作用大、并发症多等问题使患者治疗效果并不理想[13,14]。因此，研发更加安全有效的抗肿瘤药物已成为人们关注的重点。现有研究[4,5,6]表明，ALT具有抗炎、抗菌、抗肿瘤及保肝降糖等多种生物活性。ALT可通过抑制ERK信号通路的活性来有效抑制多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞的增殖并促进其凋亡，同时还可抑制裸鼠皮下移植瘤的生长[15]。ALT通过选择性地抑制线粒体和PI3K/AKT信号通路的活性，抑制三阴性乳腺癌MCF-7细胞的增殖[16]。上述研究结果表明，ALT可以通过多种信号通路发挥抑癌作用。然而目前尚未见ALT对人骨肉瘤的影响和作用机制的研究报道。

本研究采用划痕愈合实验、Transwell小室法检测了ALT对143B细胞的迁移和侵袭的影响，结果显示ALT处理组中细胞的划痕愈合率和穿膜细胞数明显减少；qPCR及WB实验结果同样表明，ALT能上调143B细胞中迁移和侵袭相关分子E-cadherin mRNA和蛋白水平，下调N-cadherin mRNA和蛋白水平，从而抑制细胞的迁移和侵袭。证实了ALT能明显抑制人骨肉瘤143B细胞的迁移和侵袭是肿瘤转移关键因素的观察[17]。

图2 ALT对143B细胞迁移和侵袭的影响（×100)

图3 ALT对143B细胞凋亡及凋亡相关分子表达的影响

图4 ALT对Wnt信号通路相关分子β-catenin及MMP-7、c-Myc蛋白和mRNA表达的影响

细胞的凋亡是一个极为复杂的过程，是一系列调控因子共同作用的最终结果[18]。Caspase家族是一个包含众多蛋白酶的家族，目前发现人体内caspase蛋白家族成员至少有11种，其中caspase-3在细胞凋亡过程中发挥凋亡执行因子的作用，当caspase-3发生剪切时，可促进细胞凋亡[19]。PARP在体外可被多种caspase剪切，在体内则是caspase-3的主要剪切对象[20]。c-PARP升高被认为是细胞凋亡的重要指标，同时也是caspase-3激活的指标[21]。本研究通过Hoechst33258染色法和qPCR及WB检测143B细胞中凋亡水平及其相关标志物的表达水平，结果显示，c-caspase-3、PARP和c-PARP蛋白水平均上调，进一步提示ALT能诱导人骨肉瘤143B细胞凋亡。

β-catenin作为Wnt/β-catenin信号通路的关键分子，一方面与黏附相关蛋白结合形成复合物，调控细胞的黏附作用；另一方面进入细胞核调控信号转导过程，影响细胞的增殖和凋亡[22]。研究[23,24]表明，当细胞中β-catenin与黏附相关蛋白形成的复合物降解受阻时，β-catenin聚积于细胞质，最终入核与TCF/LEF结合，启动下游靶基因（如MMP-7、c-Myc）的转录，导致细胞异常增殖。本研究结果表明，ALT可抑制骨肉瘤143B细胞中TCF/LEF的转录活性，并在mRNA和蛋白水平上下调β-catenin及下游靶分子MMP-7和c-Myc的表达。结果提示，Wnt/β-catenin信号通路参与ALT对人骨肉瘤143B细胞的调控。有研究[25,26,27,28,29,30,31]发现，Wnt/β-catenin信号途径在调控淋巴瘤、胃癌、乳腺癌、脑胶质瘤、白血病、结肠癌和非小细胞肺癌等多种肿瘤细胞的发生发展过程中发挥重要作用。

综上所述，ALT可通过影响Wnt/β-catenin信号通路的活性来抑制人骨肉瘤143B细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并诱导细胞凋亡。研究结果提示，ALT有望作为一种安全有效的抗肿瘤新型药物，为后续进一步治疗骨肉瘤等疾病提供了新思路。后续本课题组将进一步了解ALT在实验动物体内对骨肉瘤细胞的影响，并对其具体的作用机制进行深入研究。

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基金:重庆市科技计划资助项目(No.cstc2017jcyjAX0039)