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研究不同临床阶段慢性HBV感染患者外周血T细胞免疫状态

2020-07-18 191 上传者：管理员

摘要：目的:探讨慢性HBV感染(CHI)不同临床阶段患者外周血T细胞状态,为CHI临床分期和防治提供科学依据。方法:本研究收录CHI患者,按照患者临床症状将其划分为免疫耐受(IT)、免疫活跃(IA)、免疫控制(IC)、再活化组(RA),健康志愿者(HD)为对照组。分离外周血单个核细胞(PBMC),使用多色流式细胞术分析患者外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞亚群频率和CD8+T细胞表面PD-1的表达量。结果:与HD相比,CHI组T细胞及亚群变化无显著差异;RA组CD3+T细胞百分比显著下降。对于CD8+T细胞亚型,IC和RA组初始CD8+T细胞(NaïveTcell,Tn)频率下降;IT组效应记忆CD8+T细胞(Tem)频率降低;而IC组效应CD8+T细胞(Te)频率显著增高(P<0.05)。相较于高HBVDNA载量组(IT),低HBVDNA载量组(IC和RA)Tn频率降低,Te频率增高(P<0.05);IA组CD8+T细胞PD-1表达量最高,其次是IC组(P<0.05)。对于CD4+T细胞亚型,与HD相比,CHI中IT和RA组中枢记忆CD4+T细胞(Tcm)频率明显升高;各组Treg频率均上升,IA组Treg频率升高较明显(P<0.05),Treg频率与ALT呈正相关(r=0.7436,P=0.0036)。结论:临床诊断指标联合CHI患者T细胞亚型频率变化及免疫抑制功能检测,对慢性HBV感染疾病的分期诊断和治疗以及预测预后转归具有重要参考意义。

关键词：
HBVDNA载量
T细胞亚型
分期诊断
慢性HBV感染
程序性死亡分子1
调节性T细胞
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WHO报道,全球大约有2.57亿慢性HBV感染者[1],中国是HBV感染的高发国家。HBV感染慢性化可导致肝硬化和肝癌,严重影响人们的身体健康[2]。CHI患者病程长久,临床症状多样,根据目前的乙肝防治指南和临床表现,慢性HBV感染被划分为四个不同临床阶段:IT、IA、IC、RA[3,4,5]。病毒活跃情况与患者免疫状态的关系密切复杂。机体对HBV免疫应答的差异造成HBV感染的不同转归。HBV诱发肝损伤过程中,T细胞免疫应答对病毒清除具有重要的作用[6,7]。虽然文献已经报道有关CHI不同临床阶段患者外周血T细胞亚群分布,但CHI不同临床阶段患者外周血T细胞亚型变化尚不清楚。因此,本研究对外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞亚型与HBV复制状态进行综合分析,同时分析CHI患者外周血CD8+T细胞表面抑制性分子PD-1的表达水平,探寻T细胞亚型变化,对CHI的临床分期诊断以及预测预后和转归可能具有重要意义。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象

选择2019年10月至2020年1月就诊于重庆医科大学附属第一医院感染科的CHI患者28例,同时纳入10名健康志愿者。纳入标准:①所有入选患者均符合2019年《慢性乙型肝炎防治指南》[3]的慢性HBV感染诊断标准;②入选患者近六个月均未接受过任何抗HBV病毒药物或保肝治疗;③患者及家属均知情同意。排除标准:①其他原因如甲乙丙丁和戊型肝炎,药物、酒精等其他原因所致的肝损害;②患者依从性差者。在纳入的28例CHI患者中,男性15例,平均年龄(36.33±12.36)岁;女性13例,平均年龄(37.38±10.91)岁;53.6%的患者检测到超过7log10copies/ml的HBVDNA拷贝数,全部为HBeAg阳性;32.1%的患者的HBVDNA拷贝数低于3log10copies/ml,全部为HBeAg阴性。参考2019年《慢性乙型肝炎防治指南》、根据研究对象的临床症状,将28例研究对象划分到HBV感染的不同阶段。IT组10例,IA组5例,IC组8例,RA组5例。

1.1.2实验试剂与仪器

流式抗体CD3-PE、CD4-PC5.5、CD8-FITC、CD45RA-APC、CCR7-BV421、CD25-BV650、CD127-APC、PD-1-BV421及同型对照抗体IgG2b-APC、IgG2b-BV421、IgG1-BV650、IgG1-APC、IgG1-BV421均购自Biolegend公司,LymphopreTM淋巴细胞分离液购自Stemcell公司,RPMI1640培养液购自Sigma公司,达优细胞冻存液购自达科为公司。流式细胞仪Celesta购自BD公司。

1.2方法

1.2.1临床资料的收集

收集患者的临床资料,包括年龄、性别等,由重庆医科大学附属第一医院检验科检测血清ALT、AST、HBVDNA拷贝数、乙肝两对半定量等。

1.2.2血液标本的采集和PBMC的提取

采集研究对象静脉血5ml于抗凝管中,摇匀,250g离心10min,收集血浆,冻存于-80℃冰箱。采用密度梯度离心法提取PBMC。将PBS缓冲液与血细胞按1∶1比例混合,取等量的淋巴细胞分离液加至混合液底部,400g离心30min,收集液面下位于第二层的白色絮状物,即PBMC,PBS缓冲液洗涤,300g离心5min,收集细胞并计数,冻存于液氮罐中。

1.2.3流式细胞术检测

检测T细胞亚型频率,实验管加入CD3-PE/CD4-PC5.5/CD8-FITC/CD45RA-APC/CCR7-BV421,同型对照管加入CD3-PE/CD4-PC5.5/CD8-FITC/IgG2b-APC/IgG2b-BV421。检测CD4+CD25+CD127-Treg频率及CD8+T细胞表面PD-1的表达量,实验管加入CD3-PE/CD4-PC5.5/CD8-FITC/CD25-BV650/CD127-APC/PD-1-BV421,同型对照管加入CD3-PE/CD4-PC5.5/CD8-FITC/IgG1-BV650/IgG1-APC/IgG1-BV421。充分混匀,室温避光孵育20min,清洗重悬,上机检测。

1.3统计学方法

采用统计学软件SPSS20.0软件和GraphPadPrism8.0软件进行统计学分析。分类资料采用χ2检验。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。相关性分析采用Pearson线性相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1CHI不同临床阶段患者外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞亚群频率分析

与HD相比,CHI中CD3+T细胞频率呈减少趋势,但无显著性差异;CD4+T细胞和CD8+T细胞频率以及CD4/CD8比值均无显著性差异。RA组CD3+T细胞百分比显著降低(P<0.05),而其他组差异无统计学意义(表1)。提示:CHI中RA期,CD3+T细胞百分比降低,免疫功能低下状态,可能对CHI疾病进展与预后预测具有重要意义。与RA期不同,IA组CD3+T细胞无显著变化,但CD4+T细胞百分比呈减少趋势,而CD8+T细胞百分比呈增高趋势,CD4/CD8比值降低,可能为区分不同免疫状态提供参考价值。

2.2CHI不同临床阶段患者外周血T细胞亚型及其与病毒载量的相关性分析

按功能和分化状态,通常将T细胞可分为Tn、Tcm、Tem和Te。图A显示T细胞各亚型的检测和分析。对于CD4+T细胞亚型,与HD相比,CHI中IT和RA组CD4+Tcm细胞百分比明显增高(P<0.05)(图1B)。对于CD8+T细胞亚型,与HD相比,CHI中IC、RA组CD8+Tn百分比下降(P<0.05);IT组CD8+Tem百分比下降(P<0.05),而IC组CD8+Te百分比显著增高(P<0.001)。CHI中,IT、IA、IC、RA组,两两之间比较,与IT组相比,IC组CD8+Tn百分比降低,CD8+Te百分比增高(P<0.05)(图1C)。分析CD8+T细胞各亚型与HBVDNA载量的关系,结果显示相较于高病毒载量组,低病毒载量组的CD8+Tn百分比降低,而CD8+Te百分比显著增高(P<0.05)(图2);CD8+Tem百分比无显著变化(结果未显示)。提示:病毒载量影响CD8+T细胞亚型百分比。病毒载量结合CD8+T细胞亚型的检测对CHI疾病的分期及预后有参考价值。

与HD相比,CHI中各组患者外周血Treg频率均呈增高趋势,差异无统计学意义(P>0.05)。CHI中IA组Treg频率显著升高,与HD及IC组相比,差异有统计学意义(P<0.01)(图3A)。分析Treg频率与HBVDNA、ALT、AST的相关性,结果显示CHI中Treg频率与ALT、AST呈正相关,差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

图1外周血T细胞亚型分析

2.3CHI不同临床阶段患者外周血PD-1+CD8+T细胞百分比分析

与HD相比,CHI中各组PD-1+CD8+T细胞百分比均显著增高(P<0.05);CHI中IT、IA、IC、RA组,两两之间比较,IA、IC组PD-1+CD8+T细胞百分比升高最为明显,其次是RA组,与HD相比,有统计学意义(P<0.05)(图3B)。

图2CD8+T细胞亚型与HBVDNA载量的关系

图3CHI不同临床阶段Treg频率及PD-1+CD8+T细胞百分比分析

表1CHI不同临床阶段患者外周血T细胞亚群分析

表2慢性HBV感染患者Treg频率与HBVDNA、ALT、AST的相关性分析

3、讨论

人体感染HBV后病情严重程度及预后差异与宿主的免疫状态密切相关[8]。其中,T细胞免疫在抗HBV感染中发挥重要作用。受到抗原刺激时,T细胞遵循从Tn向Tcm、Tem、Te等T细胞群体分化的渐进过程[9,10,11]。抗原类型、抗原量及持续时间及炎症细胞因子环境等多种变化都会影响T细胞的分化水平和效应功能[12,13]。Treg细胞和免疫抑制性分子如PD-1的表达,在CHI中也发挥着重要的免疫调节作用。Treg是一群具有免疫负调节作用的细胞群,能抑制CD4+T细胞对CD8+T细胞的辅助作用,还能通过分泌抑制性细胞因子非特异性抑制CD4+T细胞、CD8+T细胞的活化和增殖[14,15]。PD-1是免疫细胞表面表达的一种抑制性分子。PD-1表达量的增加,一方面能抑制T淋巴细胞增殖和功能,对减轻肝脏的炎症反应,防止肝脏细胞被大量破坏而引起的肝功能衰竭具有积极的作用,另一方面高表达PD-1的CD8+T细胞处于耗竭状态促使HBV感染的慢性化[16]。

与HD比较,CHI患者外周血T细胞亚群的变化,文献报道不一致[17,18,19]。与Wang等报道一致,我们的研究结果显示,与HD相比,CHI的T细胞亚群无显著差异。因此,CD3+T细胞的百分比对CHI的免疫功能状态评估和参考尚需要大样本分析明确其价值和意义。而在CHI中的RA组CD3+T细胞百分比明显下降,但CD4+T细胞呈上升趋势,Treg频率明显升高;CD8+T细胞百分比变化不显著,但PD-1+CD8+T细胞百分比明显增加。这些提示RA期免疫功能处于抑制状态。因此,CD3+T细胞百分比下降、Treg和PD-1+CD8+T细胞频率升高,为CHI处于RA期诊断提供参考。同时RA期免疫功能处于低下状态,预示疾病发展进程及预后转归不良。

与Gu等[19]报道相符,结果显示,IA组CD4+T细胞百分比呈下降趋势,但Treg频率明显上升,且与ALT水平正相关;CD8+T细胞百分比呈上升趋势,PD-1+CD8+T细胞百分比显著上升;CD4/CD8比值明显减小,提示机体细胞免疫功能处于活跃状态,可能预测肝脏炎症的严重程度。与RA期免疫功能状态不同,IA期CD3+T细胞频率没有明显减少,但是CD4/CD8比值变化明显,这些表明RA期与IA期的免疫功能处于不同状态,临床疾病预后与转归不同。

IT组HBVDNA载量最高,与HD相比,CD8+Tem细胞百分比明显下降。Tem是CHI患者病毒特异性CD8+T细胞的主要T细胞亚型[20]。CD8+Tem细胞百分比的降低提示T细胞免疫功能缺乏和(或)功能不足,是导致CHI患者发生免疫耐受(IT)的重要原因。因此,CD4+Tem和CD8+Tem细胞百分比下降和病毒载量异常升高提示CHI的免疫耐受状态(IT)。我们结果发现低病毒载量的IC组CD8+Te百分比较高,提示CD8+Te清除病毒能力较强的免疫功能状态。因此,低病毒载量结合Te升高提示CHI处于IC期,预测疾病良好的预后和转归。

通常T细胞高表达PD-1,一方面提示T细胞活化状态,另一方面也提示T细胞走向耗竭趋势即免疫功能耗竭。我们的研究显示:CHI组的PD-1+CD8+T细胞频率高于HD,提示病理状态下的免疫功能处于活跃状态清除病毒,病毒载量下降如IA和IC期;另一方面,免疫功能处于抑制状态,病毒大量复制或持续波动状态如IT和RA期。所以,通过PD-1+CD8+T细胞的百分比结合病毒载量可能辅助预测临床免疫状态和临床分期。

虽然,我们的研究未能追踪同一个患者的慢性HBV感染不同临床阶段的免疫状态,同时样本量少尚有待扩大样本深入研究。但我们纳入了CHI不同临床阶段患者,综合分析了CHI患者外周血T细胞、Treg及PD-1的表达变化,在一定程度上能提示疾病进展过程中的T细胞免疫分化情况,对临床了解慢性HBV感染疾病的发展,开展合理的免疫治疗具有重要意义。

总之,我们的研究指出CHI不同临床阶段患者外周血T细胞亚型有显著性差异,低病毒载量的IC组CD8+Te细胞频率显著增高,提示疾病的良好预后转归。CHI中CD8+T细胞表面PD-1的表达量增加,提示机体两种不同的免疫状态,预测疾病不同的免疫转归。Treg频率与机体ALT水平呈正相关,提示可用于预测肝炎疾病的严重程度。联合检测CHI患者T细胞免疫状态,对慢性HBV感染疾病的分期诊断和治疗以及预测预后转归具有重要参考意义。

参考文献：

[3]王贵强,王福生,庄辉,等.慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)[J].中华实验和临床感染病杂志,2019,13(6):441-466.

罗雅煊,李婷婷,王嘉悦,秦波,金艾顺.慢性HBV感染不同临床阶段患者外周血T细胞免疫状态的研究[J].中国免疫学杂志,2020,36(12):1494-1498.