食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，在中国恶性肿瘤发病率和病死率中分别位居第5位和第4位，其中90%以上的病理类型为食管鳞状细胞癌，中晚期ESCC患者的5年生存率不到30%[1]。肿瘤细胞侵袭和转移是影响ESCC患者预后的主要因素[2]，因此探讨ESCC细胞侵袭和迁移的相关机制对于建立精准治疗方法具有重要意义。长链非编码RNA是指长度大于200个核苷酸、缺乏蛋白质编码能力的RNA分子。DNA损伤激活的非编码RNA是位于细胞核中具有促癌作用的lncRNA[3,4]。国内外诸多研究[5,6,7,8]证实，NORAD在非小细胞肺癌、结直肠癌、宫颈癌、胃癌等发生发展中发挥重要的作用。有研究[9]表明，NORAD在ESCC组织中高表达，其表达水平与ESCC患者的不良预后相关。然而，尚未见NORAD在ESCC细胞中的表达和作用机制的研究报道。本研究通过检测NORAD在不同ESCC细胞中的表达水平，进一步探讨其对EC9706细胞增殖和迁移能力的影响及其作用机制。

1、材料与方法

1.1细胞系及主要试剂

人ESCC细胞系EC9706、TE1、YES-2、KYSE150由河北医科大学第四医院科研中心提供，置于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基中，在37‧、5%CO2培养箱中常规培养。

RPMI1640培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自美国Gemini公司，胰蛋白酶、TRIzol试剂及一步法逆转录试剂盒均购自美国Thermo公司，qPCR试剂盒购自爱博泰克生物公司，MTT试剂盒购自迈瑞尔公司，转染试剂LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司。NORAD引物由上海生工公司设计合成，NORAD的干扰序列、阴性对照寡核苷酸均由上海吉玛基因公司设计合成。兔抗人神经钙黏蛋白、上皮钙黏蛋白、Snail抗体购自华安生物公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自Abcam公司。

1.2RT-PCR法检测ESCC细胞系中NORADmRNA的表达

采用TRIzol试剂提取细胞总RNA，检测RNA的浓度及纯度后合成cDNA。以cDNA为模板，按照RT-PCR试剂盒说明书对NORAD进行扩增。引物序列：NORAD(362bp)F为5'-TCCCATCACCATCTTCCAGG-3',R为5'-CCGTTGTCGTCAGGACTAGGTAGG-3';GAPDH(100bp)F为5'-TCCCATCACCATCTTCCAGG-3',R为5'-CCATCACGCCACAGTTTCC-3'。取5µlmaker和8µlPCR扩增产物，分别加样于1.2%琼脂糖凝胶加样孔中做水平电泳40min，用凝胶成像系统拍摄图像并分析，根据目的片段NORADmRNA与GAPDHmRNA灰度值的比值对其进行半定量分析。

1.3RNA干扰技术敲低EC9706细胞NORAD基因的表达

选取对数生长期的EC9706细胞，接种到6孔板（细胞密度为5×105个/ml），并继续培养24h，待细胞汇合度至80%时分为NORAD敲低组（si-NORAD组，转染NORAD干扰序列）、阴性对照组（NC组，转染RNA干扰阴性对照序列）及空白对照组（Ctrl组，不转染任何序列）。3对干扰片段及阴性对照序列分别为NORADsiRNA-1:5'-GGAAGAUUUACUGGCCGUUTT-3';NORADsiRNA-2:5'-CCUGACAACG-GACAAATT-3';NORADsiRNA-3:5'-GCGGUUGGUCUUCAUUCUATT-3'。RNA干扰阴性对照（interferingnegativecontrol):5'-UUCUCCGAACGUGUCUTT-3';5'-AUGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。转染步骤均按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书进行操作。转染48h后，抽提各组细胞内的RNA和总蛋白。

1.4qPCR法检测NORAD-siRNA转染效果

提取各组细胞总RNA后逆转录为cDNA进行扩增，cDNA扩增反应条件：95‧预变性2min;95‧变性15s、59‧退火15s、72‧延伸30s，进行35个循环；72‧延伸10min。根据每孔荧光信号达到阈值时经历的循环数作为Ct值，以2-∆∆Ct法计算NORADmRNA的相对表达量。

1.5MTT实验检测敲低NORAD对EC9706细胞克隆形成能力的影响

将各细胞按照3×103个/孔细胞量接种于96孔板中，于接种后不同时间点分别向每孔加入100μl培养基和10μlMTT溶液，37‧培养箱孵育4h，后加入110μlDMSO于培养箱继续培养30min，然后使用酶标仪检测波长在492nm处的光密度（D）值，绘制细胞生长曲线，D值设为纵坐标，时间设为横坐标。

1.6平板克隆形成实验检测敲低NORAD对EC9706细胞增殖的影响

将各组细胞按照5×102个/孔细胞量接种于6孔板中于培养箱中培养。更换培养液时，在光学显微镜下（×100）计数每孔细胞的克隆数，克隆形成的标准为每个细胞团的细胞数≥50个。克隆形成后，4%多聚甲醛固定30min后用吉姆萨溶液染色30min，计数染色的克隆数，并拍照、绘制数据图。

1.7划痕愈合实验检测敲低NORAD对EC9706细胞迁移的影响

细胞转染24h后，用200μl枪头在各组细胞中划2条垂直于背面平行线的直线，后加入2ml含1%胎牛血清的1640培养基，此后不同时间在倒置显微镜下观察细胞向致伤区域的迁移距离并拍照。

1.8Westernblotting(WB）检测敲低NORAD对EC9706细胞E-cadherin、N-cadherin及Snail表达的影响

分别提取各组细胞总蛋白，行10%SDS-PAGE分离蛋白后电转移至PVDF膜。加入兔抗人E-cadherin(1∶7000）、N-cadherin(1∶1000）、Snail(1∶500）一抗4‧孵育过夜。次日加入HRP标记的山羊抗兔二抗（1∶20000）孵育1h后，采用ECL行放射自显影。用QuantityOne4.6软件分析图像，以β-actin为内参，与各个检测蛋白条带的灰度值之比表示蛋白的相对表达量。

1.9统计学处理

RT-PCR、qPCR、MTT、平板克隆形成、划痕愈合和WB实验均重复3次。用SPSS25.0软件对所有数据进行统计学处理。正态分布的数据以表示，两组间均数比较采用t检验；方差齐时用最小显著差法作两两比较，方差不齐时采用近似t检验作两两比较。以P<0.05或P<0.01表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1NORAD在EC9706细胞系中呈高表达状态

RT-PCR检测结果（图1）显示，NORADmRNA在不同ESCC细胞EC9706、TE1、YES-2和KYSE150中均呈高表达状态，与TE1、YES-2、KYSE150细胞比较，以EC9706细胞中NORAD表达水平最显著（F=78.95，均P<0.01），所以，后续实验选用该细胞株。

图1不同ESCC细胞系中NORADmRNA的表达

2.2成功构建NORAD低表达的EC9706细胞

qPCR检测结果（图2）显示，与NC组比较，转染NORAD-siRNA后，EC9706细胞中NORAD表达水平显著降低（F=65.46，均P<0.01），表明已成功构建NORAD低表达的EC9706细胞。其中，以si-NORAD-1组EC9706细胞NORAD下降水平最显著，所以后续实验选取该序列细胞。

图2转染NORAD-siRNA后EC9706细胞中NORADmRNA的表达

2.3敲低NORAD后抑制EC9706细胞的增殖能力

MTT实验结果（图3A）显示，与Ctrl组和NC组比较，自24h起si-NORAD组细胞的增殖能力显著降低（F=29.16,P<0.05),48至96h时差异更为显著（F=3.53、13.83、50.26，均P<0.01）。平板克隆形成实验结果（图3B）显示，si-NORAD组细胞的克隆形成率显著低于Ctrl组和NC组（F=43.98,P<0.05），而Ctr组和NC组差异比较无统计学意义（P>0.05）。结果表明，敲低NORAD可以抑制EC9706细胞的增殖能力。

图3敲低NORAD表达抑制EC9706细胞的增殖能力

2.4敲低NORAD后抑制EC9706细胞的迁移能力

划痕愈合实验结果（图4）显示，与Ctrl组和NC组相比，在24和48h时si-NORAD组EC9706细胞的迁移率显著降低（F=14.08、19.52，均P<0.01），而Ctrl组和NC组差异比较无统计学意义（P>0.05）。结果表明，敲低NORAD能够显著抑制EC9706细胞的迁移能力。

图4敲低NORAD表达抑制EC9706细胞的迁移能力

2.5敲低NORAD上调EC9706细胞中E-cadherin表达而下调N-cadherin及Snail表达

WB实验结果（图5）显示，与Ctrl组和NC组相比，si-NORAD组EC9706细胞中E-cadherin表达水平显著升高（F=24.57,P<0.01），而N-cadherin(F=8.86,P<0.05）及Snail(F=57.6,P<0.01）表达水平显著降低，而Ctrl组和NC组差异比较无统计学意义（P>0.05）。结果表明，敲低NORAD可上调E-cadherin表达同时下调N-cadherin及Snail表达。

图5敲低NORAD后对EC9706细胞E-cadherin、N-cadherin和Snail蛋白表达的影响

3、讨论

肿瘤的发生发展是一个多因素、多步骤的复杂过程，表观遗传调控在其中发挥着重要作用。lncRNA因其不具有蛋白质编码能力，曾被定义为转录噪声，但随着新一代高通量测序技术的应用和发展，越来越多的研究[10,11,12,13,14]表明，lncRNA能够通过多种机制调控基因和蛋白表达，参与肿瘤进展，其表达水平可作为肿瘤早期诊断、预测复发转移及预后的生物标志物[10,11]。本研究通过体外实验证实，lncRNANORAD与ESCC细胞的增殖和迁移密切相关。

lncRNANORAD是一种长度为5378个核苷酸，由DNA损伤激活的高度保守的ncRNA，其定位于染色体20q11.23，在维持基因组稳定性中发挥调控功能[3]。研究[5,6,7,8]表明，NORAD在非小细胞肺癌、结直肠癌、宫颈癌、胃癌等肿瘤组织及细胞中高表达，并且可通过调控抑癌基因表达、转录干扰及转录后调控等多种机制发挥致癌功能。有研究[9]证实，NORAD在ESCC组织中高表达，但是其在ESCC细胞中的表达水平及其对ESCC细胞恶行生物学行为的影响机制的研究尚无报道。因此，本研究首先通过RT-PCR检测4种ESCC细胞中NORAD的表达水平，结果发现其在EC9706、TE1、YES-2和KYSE150细胞中均呈高表达状态，以EC9706细胞中表达水平最高。进一步利用RNA干扰技术建立NORAD低表达的EC9706细胞，通过MTT、平板克隆形成实验证明敲低NORAD表达可以显著抑制EC9706细胞的增殖，同时划痕实验证明敲低NORAD显著抑制EC9706细胞的迁移，说明NORAD可以调控ESCC细胞的恶性生物学行。

转移是恶性肿瘤最显著的生物学特征之一[15]，在ESCC进展中发挥至关重要的作用。上皮间质转化是指上皮细胞逐渐失去上皮分化表型同时获得间质表型的过程，与肿瘤转移密切相关。EMT进程中，上皮细胞极性消失，上皮细胞间黏附作用下降，从而发生细胞骨架和形态改变、细胞侵袭和迁移能力提高[16]。发生EMT的重要标志是上皮标志物（如E-cadherin、ZO-1等）表达下调而间质标志物（如N-cadherin、Snail、Twist等）表达上调[17]。其中E-cadherin是上皮细胞表面的黏附分子，对细胞间的黏附起重要作用，其表达下调使细胞间黏附能力下降，细胞的侵袭和迁移能力增强；Snail是EMT过程中的关键转录因子，其通过与E-cadherin的启动子区E-box结构结合，抑制E-cadherin的转录表达，致使细胞间黏附力降低，诱导EMT发生，促进肿瘤细胞迁移[18,19]。为了明确NORAD调控ESCC的发展和转移的作用机制，本研究发现，敲低EC9706细胞中NORAD表达后，可以显著升高E-cadherin表达而下调N-cadherin和Snail的表达，结果说明NORAD或可通过上调N-cadherin和Snail表达而下调E-cadherin表达促进EC9706细胞的迁移能力。

综上所述，本研究证实lncRNANORAD在ESCC细胞中呈高表达状态，敲低NORAD基因可以显著抑制EC9706细胞的增殖，并通过上调E-cadherin表达、下调N-cadherin和Snail的表达抑制EC9706细胞的迁移能力。本研究为深入探讨NORAD在ESCC转移中的作用及逆转治疗奠定了实验基础。

参考文献：

[10]刘天旭,王梦杰,田聪,等.lncRNANEAT1通过抑制DNA损伤促进肺腺癌PC-9细胞的增殖[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2019,26(8):845-849.

[19]王佳丽,张翔宇,邓佳,等.Bin1基因通过NF-κB途径抑制非小细胞肺癌A549细胞的迁移和侵袭能力[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2016,23(4):481-485.

李欢,张评梅,王郁,王佳丽,段玉青,刘丽华.lncRNANORAD促进食管鳞状细胞癌EC9706细胞的增殖和迁移[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2020,27(04):359-364.