支气管哮喘是一种常见的呼吸道疾病，临床表现为反复发作的喘促、咳嗽、咳痰，严重影响患者的生活质量，已成为公认的全球性健康问题。桂芍子喘颗粒是中日友好医院李友林教授为治疗肺脾两虚、肺失宣降所致的支气管哮喘所创制的临床经验方，全方由生黄芪、桂枝、炒术、苏子、白芍、五味子、甘草等11味中药组成，具有健脾益肺、降气平喘的功效[1,2]。该方对支气管哮喘患者的临床症状和体征有显著改善作用，但对其止咳、平喘、祛痰作用的药效研究尚未见报道。本研究分别采用乙酰甲胆碱及磷酸组胺引喘豚鼠模型、氨水引咳小鼠模型、枸橼酸引咳豚鼠模型、小鼠气管段酚红排泌量实验，观察桂芍子喘颗粒的平喘、镇咳和祛痰作用，以期为进一步探索其药理作用，指导临床合理应用提供依据。

1、材料与方法

1.1仪器与试药

402A型超声雾化器(江苏鱼跃医疗设备有限公司);全自动多功能酶标仪(Thermo公司)。

桂芍子喘颗粒，由生黄芪、桂枝、炒白术、苏子、白芍、五味子、生甘草等组成，全方共98g，为成人1日用量，由北京中医药大学中药制药系提供，批号:20180103,1g浸膏相当于7.35g生药量，按照成人日用量换算，小鼠的等效剂量为1.86g·kg-1，豚鼠的等效剂量为1.30g·kg-1，分别取其2倍和1/2作为高、低剂量;六君子丸(吉林紫鑫药业股份有限公司，规格:9g/袋，批号:171215);玉屏风颗粒(国药集团，规格:5g/袋，批号:180516);氨茶碱片(天津力生制药股份有限公司，规格:0.1g/片，批号:1705008);氢溴酸右美沙芬糖浆(仁和药业，规格:150mg∶100ml，批号:180711);盐酸氨溴索(山东裕欣药业有限公司，批号:617092039)。实验时各药物(除氢溴酸右美沙芬糖浆)以纯净水充分溶解，豚鼠灌胃给药容积为10ml·kg-1·d-1，小鼠灌胃给药容积为0.1ml·10kg-1·d-1。

水合氯醛(国药集团，批号:20170421);磷酸组胺(批号:3410)和乙酰甲胆碱(批号:r621712)购自BioRuler;氨水(北京化工厂，批号:20141008);枸橼酸(批号:126E041)和酚红(批号:1211C031)购自Salarbio公司。

1.2动物

SPF级豚鼠，雌雄各半，体质量200～230g，由北京科宇动物养殖中心提供，生产许可证号:SCXK(京)2015-0007，质量合格证号:1103201911000515。SPF级ICR小鼠，雌雄各半，体质量25～30g，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供，生产许可证号:SCXK(京)2016-0002，质量合格证号:11401500051687。动物于实验前适应性饲养7d，实验期间，保持动物房室温在(22±2)℃，相对湿度70%左右，光照条件12h/12h明暗交替。动物自由进食，自由饮水。

1.3方法

1.3.1桂芍子喘颗粒对乙酰甲胆碱和磷酸组胺引喘豚鼠的影响

将豚鼠分别放入雾化箱内，以超声雾化器雾化0.1%磷酸组胺+2%乙酰甲胆碱等容积混合液，喷雾10s，喷雾停止后持续观察，记录引喘潜伏期(即从喷雾开始到哮喘发作、呼吸困难，直至抽搐跌倒的时间)。引喘潜伏期小于120s者为阳性，超过120s者则不予选用。60只阳性豚鼠随机分为6组:模型组、桂芍子喘颗粒低剂量(0.650g·kg-1·d-1)、中剂量(1.300g·kg-1·d-1)、高剂量(2.600g·kg-1·d-1)组、氨茶碱组(0.058g·kg-1·d-1)、六君子丸+玉屏风颗粒组(1.750g·kg-1·d-1+1.46g·kg-1·d-1)，每组10只。各药物分别以纯净水充分溶解，药物浓度分别为桂芍子喘颗粒低剂量(0.065g·ml-1)、中剂量(0.130g·ml-1)、高剂量(0.260g·ml-1)、氨茶碱(0.0058g·ml-1)、六君子丸+玉屏风颗粒(0.175g·ml-1+0.146g·ml-1)。各组分别按剂量灌胃给药，模型组给与同等容积的纯净水，1次/d，连续给药7d。于末次给药1h后，用上法测定豚鼠的引喘潜伏期[3,4]。

1.3.2桂芍子喘颗粒对氨水引咳小鼠的影响

60只小鼠随机分为6组:模型组、桂芍子喘颗粒低剂量(0.930g·kg-1·d-1)、中剂量(1.860g·kg-1·d-1)、高剂量(3.720g·kg-1·d-1)组、氢溴酸右美沙芬糖浆组(8.4ml·kg-1·d-1)、六君子丸+玉屏风颗粒组(2.5g·kg-1·d-1+2.1g·kg-1·d-1)，每组10只。各药物除氢溴酸右美沙芬糖浆外分别以纯净水充分溶解，药物浓度分别为桂芍子喘颗粒低剂量(0.093g·ml-1)、中剂量(0.186g·ml-1)、高剂量(0.372g·ml-1)、六君子丸+玉屏风颗粒(0.250g·ml-1+0.210g·ml-1)。各组分别按剂量灌胃给药，模型组给与同等容积的纯净水，1次/d，连续给药3d。末次给药1h后，将小鼠置于500ml烧杯中，放入已注入12.5%氨水0.2ml的棉球，1min后取出棉球，继续观察2min。记录小鼠咳嗽潜伏期(从放入棉球到小鼠第1次咳嗽的时间为潜伏期)及咳嗽次数。咳嗽标准:腹肌收缩或缩胸，同时张大嘴，有时可闻咳声[3,5]。

1.3.3桂芍子喘颗粒对枸橼酸引咳豚鼠的影响

将豚鼠分别放入雾化箱内，以超声雾化器雾化17.5%枸橼酸，喷雾1min，喷雾停止后继续持续刺激豚鼠4min，测定5min内豚鼠的咳嗽次数，大于10次者为阳性，10次以下者弃去不用。筛选阳性豚鼠60只按“1.3.1”项下方法分组及给药，1次/d，连续给药3d。于末次给药1h后，用上法测定刺激豚鼠5min内的咳嗽潜伏期及咳嗽次数[3,6]。

1.3.4桂芍子喘颗粒对小鼠气管段酚红排泌量的影响

1.3.4.1酚红标准曲线的绘制

准确称取1mg酚红，用5%NaHCO3溶液和生理盐水按照1∶15的比例配制成的A溶液溶解，将溶液移至100ml量瓶中，标记为B溶液，分别精密量取0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2ml的B溶液于5ml量瓶中，加入A溶液定容至刻度，测定吸光度(A)值。以酚红浓度为横坐标(X),A值为纵坐标(Y)绘制标准曲线。

1.3.4.2桂芍子喘颗粒对小鼠气管段酚红排泌量的影响

60只小鼠随机分为6组:模型组、桂芍子喘颗粒低剂量(0.930g·kg-1·d-1)、中剂量(1.860g·kg-1·d-1)、高剂量(3.720g·kg-1·d-1)组、盐酸氨溴索组(0.030g·kg-1·d-1)、六君子丸+玉屏风颗粒组(2.500g·kg-1·d-1+2.100g·kg-1·d-1)，每组10只。各药物分别以纯净水充分溶解，药物浓度分别为桂芍子喘颗粒低剂量(0.093g·ml-1)、中剂量(0.186g·ml-1)、高剂量(0.372g·ml-1)、盐酸氨溴索(0.003g·ml-1)、六君子丸+玉屏风颗粒(0.250g·ml-1+0.210g·ml-1)。各组分别按剂量灌胃给药，模型组给与同等容积的纯净水，1次/d，连续给药3d。末次给药30min后，各小鼠按0.2ml/10g腹腔注射2.5%酚红溶液，30min后处死小鼠。稍等片刻使小鼠血液凝固，剪开颈部无明显出血现象，以避免血液里的酚红沾染到气管壁上影响实验结果。剥离气管周围组织，剪下自甲状腺软骨至气管分叉处的气管，放入5%NaHCO3溶液与生理盐水比例为1∶15的2ml混合液中冲洗。洗出液置于酶标仪上于546nm波长处检测A值，并根据制定的标准曲线计算出气管冲洗液中酚红浓度，以此表示酚红排泌量[5,7]。

1.4统计方法

采用SAS9.2软件进行统计分析，数据均以x±s表示。若各组服从正态分布且方差齐，采用单因素方差分析，两组比较采用q检验;若各组不服从正态分布或方差不齐，采用非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1桂芍子喘颗粒对乙酰甲胆碱和磷酸组胺引喘豚鼠的影响

乙酰甲胆碱和磷酸组胺喷雾后，各组豚鼠在不同时间均出现哮喘反应。与模型组比较，桂芍子喘颗粒高剂量组、六君子丸+玉屏风颗粒组、氨茶碱组引喘潜伏期明显延长(P<0.01)，桂芍子喘颗粒低、中剂量组引喘潜伏期延长，但差异无统计学意义(P>0.05)。与西药阳性药氨茶碱组比较，桂芍子喘颗粒高剂量平喘作用与氨茶碱相当，中、低剂量组引喘潜伏期明显缩短(P<0.01)。桂芍子喘颗粒的平喘作用呈现一定的量效关系，中、低剂量组与高剂量组比较引喘潜伏期明显缩短(P<0.05或P<0.01)。结果见表1。

表1桂芍子喘颗粒对乙酰甲胆碱和磷酸组胺引喘豚鼠的影响

2.2桂芍子喘颗粒对氨水引咳小鼠的影响

氨水诱发后，各组小鼠在不同时间均出现咳嗽反应。与模型组比较，桂芍子喘颗粒中、高剂量组、氢溴酸右美沙芬糖浆组及六君子丸+玉屏风颗粒组咳嗽潜伏期均明显延长(P<0.01)，桂芍子喘颗粒各剂量组、氢溴酸右美沙芬糖浆组及六君子丸+玉屏风颗粒组咳嗽次数明显减少(P<0.05或P<0.01)。与氢溴酸右美沙芬糖浆组比较，桂芍子喘颗粒各剂量组咳嗽潜伏期明显缩短(P<0.01)，低、中剂量组咳嗽次数明显增多(P<0.01);与六君子丸+玉屏风颗粒组比较，桂芍子喘颗粒中、低剂量组咳嗽潜伏期均明显缩短(P<0.01)，咳嗽次数明显增多(P<0.01)。桂芍子喘颗粒低、中剂量组的镇咳作用较高剂量组弱(P<0.05或P<0.01)。结果见表2。

表2桂芍子喘颗粒对氨水引咳小鼠的影响

2.3桂芍子喘颗粒对枸橼酸引咳豚鼠的影响

枸橼酸喷雾后，各组豚鼠在不同时间均出现咳嗽反应。与模型组比较，桂芍子喘颗粒各剂量组、氨茶碱组和六君子丸+玉屏风颗粒组豚鼠的咳嗽次数显著减少(P<0.05或P<0.01);桂芍子喘颗粒高、中剂量组、氨茶碱组及六君子丸+玉屏风颗粒组豚鼠的咳嗽潜伏期显著延长(P<0.01)。桂芍子喘颗粒各剂量组与氨茶碱组、六君子丸+玉屏风颗粒组比较，豚鼠的咳嗽次数和咳嗽潜伏期差异均无统计学意义(P>0.05)。桂芍子喘颗粒各剂量组间两指标的差异亦无统计学意义(P>0.05)。结果见表3。

表3桂芍子喘颗粒对枸橼酸引咳豚鼠的影响

2.4桂芍子喘颗粒对小鼠气管段酚红排泌量的影响

测得各溶液的A值分别为0.236,0.4096,0.5681,0.7904,0.9934,1.1595,1.3749,1.5525,1.7345,1.8793,2.1008,2.2124。酚红标准曲线的线性回归方程为:Y=0.9223X+0.052,r=0.9992，根据曲线计算酚红的量。与模型组比较，桂芍子喘颗粒高、中剂量组、盐酸氨溴索组和六君子丸+玉屏风颗粒组酚红排泌量显著升高(P<0.05或P<0.01)。与盐酸氨溴索组及六君子丸+玉屏风颗粒组比较，桂芍子喘颗粒低剂量组酚红排泌量显著降低(P<0.01)。桂芍子喘颗粒各剂量组小鼠气管段的酚红排泌量与给药剂量呈正相关，且低、高剂量组间差异有统计学意义(P<0.01)。结果见表4。

表4桂芍子喘颗粒对小鼠气管段酚红排泌量的影响

3、讨论

支气管哮喘属于中医“哮病”、“喘病”范畴。中日友好医院李友林教授针对支气管哮喘“本虚标实”的病机特征，采用肺脾为核心的脏腑整体辩证理念，将“温润辛金法”与“扶正培本”原则相结合，创立“温润辛金培本”法则治疗支气管哮喘，桂芍子喘颗粒即是依据此法并结合多年临床经验而创制的中药复方。方中黄芪，健脾益肺、补气固表;桂枝，温通经脉、助阳化气，两药共成健脾益肺培本之功，用为君药。白术、苏子两药，健脾消痰、培土生金、降气平喘，共为臣药。白芍、五味子佐君药、臣药温阳健脾，降气消痰平喘。使药甘草有补脾益气，祛痰止咳，调和诸药功效。本研究对桂芍子喘颗粒的镇咳、化痰、平喘的药效作用进行了初步实验研究，为验证其临床疗效提供科学的实验数据支持。

乙酰甲胆碱及磷酸组胺引喘豚鼠模型为模拟哮喘呼吸道阻塞症状常用模型。乙酰甲胆碱为M受体激动药，可致使支气管平滑肌发生收缩现象;磷酸组胺通过作用于组胺受体使呼吸道平滑肌发生收缩，造成毛细血管水肿，并能促进气道黏液的分泌，引起呼吸困难[8]。两者混合液可使支气管平滑肌收缩甚至发生痉挛现象，出现呼吸困难、抽搐跌倒等哮喘的症状。以乙酰甲胆碱和磷酸组胺混合液为激发剂引喘豚鼠，可直接引起动物气道收缩，常用于验证和评价药物对哮喘发作控制的效果。豚鼠哮喘发作时，按反应症状分为4级:Ⅰ级出现呼吸加快，Ⅱ级有呼吸困难的症状，Ⅲ级出现咳嗽的现象，Ⅳ级开始抽搐跌倒。前3级没有明显的界限，且哮喘发作迅速，每级间间隔很短，故以Ⅳ级抽搐跌倒时间为哮喘潜伏期。实验结果表明，桂芍子喘颗粒能延长急性支气管哮喘豚鼠模型的引喘潜伏期，说明该药对外来刺激引起的支气管平滑肌收缩、痉挛有一定的治疗作用，能缓解哮喘的发作。

咳嗽作为人体清除呼吸道内的分泌物或异物的保护性呼吸反射动作，是支气管哮喘、肺炎等疾病的常见症状。非自主咳嗽由完整的反射弧构成:咳嗽感受器→传入神经→咳嗽中枢→传出神经→效应器官，能够从某种程度上体现气道反应性的高低。镇咳实验中采用的氨水、枸橼酸均为较强的化学刺激因子，机体受到此类化学因子攻击后，刺激呼吸道感受器，继而引发咳嗽。浓氨水诱发小鼠的咳嗽反应变异性较大，一般作为初筛镇咳药的实验。而豚鼠免疫系统发达，对化学刺激物敏感，较易刺激到其喉上神经而产生咳嗽的症状，并且咳嗽现象也极易观察[9]。故本实验进一步采用雾化枸橼酸溶液引咳豚鼠的实验，更全面地观察桂芍子喘颗粒的镇咳和缓解气道高反应性的作用。用化学物质引咳小鼠、豚鼠的实验结果表明，桂芍子喘颗粒各剂量均能抑制咳嗽反射，延长咳嗽潜伏期并且减少咳嗽次数，但其镇咳作用机理仍待进一步探究。

痰液为人体呼吸道的分泌物，由气管、支气管、鼻、喉等黏膜分泌。正常生理状态下，呼吸道分泌的黏液很少，可起到保持呼吸道湿润的作用，当有炎症存在时，痰液会积聚、黏稠，不易排出。气道中的痰液能刺激气管黏膜从而引起咳嗽，继而引起哮喘发作加重，存在小气道内的黏痰也可引起气管狭窄导致窒息。祛痰药的机制是增加气道黏膜下腺分泌、促进气道上皮细胞纤毛的移动，使痰易于咳出。祛痰实验是运用酚红腹腔注射后经血液循环到达肺部，在气管的分泌作用下可在气管壁检测到的原理，以酚红为指示剂，计算排泌量，间接评价药物的祛痰效果[10]。本实验结果表明，桂芍子喘颗粒能够增加小鼠气管段的酚红排泌量，使附着在气管黏膜的浓痰变稀从而从气管壁脱落，提示其有一定的促进痰液排泌的作用[11]。

以上研究结果表明，桂芍子喘颗粒具有一定的平喘、镇咳及祛痰作用，为其临床进一步应用提供了一定的实验依据，但其发挥药效的有效成分和确切作用机制有待进一步研究。

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