苯并芘{benzo(a)pyrene,B[a]P}是一种通过煤炭、石油等物质燃烧,食物高温烹调还有吸烟等方式而产生的多环芳烃化合物,广泛存在于人们生产与生活环境中[1]。据报道,B[a]P除了可以导致肺癌的发生外[2],它的神经毒性也引起了人们的广泛关注。本课题组之前的研究发现,B[a]P可以影响大鼠的学习记忆功能和造成海马的损伤[3]。表观遗传学是指不改变DNA序列的前提下,基因表达发生了改变并导致表型变化的一门学科[4],常见的表观遗传学修饰有DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA调控等,其中DNA甲基化是最常见、最主要也是研究最多的一种表观遗传学修饰方式,与多种复杂综合征、癌症等都有密切关系[5]。青春期是大脑发展高级认知能力与运动能力的关键时期[6],为了探讨大鼠从青春期B[a]P持续暴露到成年后海马损伤过程与DNA甲基化之间的关系,本研究采用B[a]P染毒4周龄的SD大鼠进行建模,检测各组大鼠海马全基因组甲基化水平,为分析B[a]P导致海马损伤的机制提供表观遗传学方面的依据。

1、材料与方法

1.1实验动物

雄性SD大鼠20只,采购于重庆医科大学实验动物中心,SPF级,3周龄。将大鼠饲养在适宜环境下[温度为(23±1)℃,相对湿度为45%～55%,12 h光照/12 h黑暗周期,自由饮食和饮水]。实验前动物适应环境1周,于第4周开始染毒。

1.2主要试剂

包括:玉米油、苯并芘粉末(美国Sigma公司),基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司),HE染色试剂盒、多聚甲醛(上海碧云天生物技术有限公司),TRIzol试剂(美国Thermo Fisher Scientific公司)等。

1.3动物模型建立

将大鼠分为B[a]P染毒组与溶剂对照组,每组各10只,采取灌胃法进行染毒。将B[a]P溶于玉米油中制成储备液,染毒浓度为2.0 mg/kg[7]。对照组采用等量玉米油进行灌胃,采用每天1次,连续7周的亚急性染毒。

1.4 Morris水迷宫实验

在连续染毒7周后,进行水迷宫实验。实验第1天将两组实验大鼠依次放在水里自由游泳,熟悉环境,适应水温;随后进行为期5 d的定位巡航实验,将每只大鼠从划分好的4个象限分别入水,记录大鼠找到平台的时间(逃避潜伏期)和游泳路径;在逃避潜伏期训练后的1 d撤除平台,进行空间探索实验,记录60 s内大鼠在目标象限活动的时间,计算时间百分比。

1.5HE染色

大鼠处死后快速分离其脑组织,将组织置于4%多聚甲醛中固定,包埋制作石蜡切片,进行脱蜡、水化、染色等常规HE染色步骤后封片,光镜下观察海马神经元形态结构。

1.6海马组织DNA的提取

B[a]P染毒组和溶剂对照组采用简单随机抽样的方法各取3只雄鼠海马组织破碎匀浆混合,取25 mg根据基因组DNA提取试剂盒步骤提取DNA,通过ND-2000 Nanodrop超微量分光光度计来测定DNA的浓度及纯度。

1.7甲基化分析

差异性甲基化区域(differentially methylated regions, DMR)指在不同样本中基因组表现出不同的甲基化状态的DNA片段[8]。委托广州锐博生物科技有限公司进行该项检测,将样品进行简化表现亚硫酸氢盐测序法(reduced representation bisulfite sequencing, RRBS)测序,检测甲基化位点的最低深度为20×,将测序的结果进行信息分析,找出DMR,进一步进行GO和KEGG功能富集分析。

1.8荧光定量PCR

取大鼠海马组织20～30 mg,用TRIzol试剂提取总RNA,检测其浓度与纯度,并随后逆转录得到cDNA;反应所得cDNA以15μL体系进行PCR反应。引物由上海生工生物工程有限公司设计合成,Tnr上游引物5′-GCGGGAGGGAGGAGAGTGAAC-3′;下游引物5′-GTGGAGAAGTTGGTGGCGATGG-3′,产物长度为307 bp; Pla2g2a上游引物5′-CTTCTACGGTTGCCATTG-3′;下游引物5′-TCTCCAGACGGTTGTAAC-3′,产物长度为101 bp;β-actin上游引物5′-GTCATCACTATCGGCAA-TG-3′;下游引物5′-GTGTTGGCATAGAGGTCT-3′,产物长度为152 bp。

1.9统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件。水迷宫实验中同时间点的两组数据采用两独立样本的t检验分析;甲基化数量与水平分析、两组间各甲基化位点间差异采用χ2检验,两两间的比较采用Bonferroni法进行校正。检验水准:α=0.05。

2、结果

2.1大鼠的空间学习和记忆功能的变化

通过Morris水迷宫实验观察两组大鼠的空间记忆和学习能力,结果显示:随着训练时间的增加,两组大鼠的逃避潜伏期时间总体趋势是减少的;从第3天开始,对照组比B[a]P染毒组逃避潜伏期缩短(P<0.05,图1A),对照组与B[a]P染毒组在定位巡航实验时代表性的游泳路径如图1B所示;空间探索实验结果显示:对照组在目标象限时间百分比明显长于B[a]P染毒组(P<0.05,图1C)。

图1 Morris水迷宫实验观察两组大鼠的空间记忆和学习能力

2.2苯并芘对海马的损害作用

通过HE染色观察大鼠海马神经细胞形态学变化,对照组神经细胞形态正常排列紧密且数量偏多,细胞膜边缘界限清晰,细胞核染色均匀;B[a]P染毒组海马神经细胞排列紊乱,胞膜边界模糊,数量减少;出现了萎缩颗粒细胞与锥体细胞呈均匀红染(图2)。

2.3全基因组甲基化数量与水平分析

对照组全基因组有1 777 826个甲基化C位点,B[a]P染毒组全基因组有1 802 071个甲基化C位点,但两组各甲基化位点水平差异无统计学意义(表1);两组大部分甲基化C位于CGI岛(CpG island)与启动子区域的CG位点(图3);此外,从不同基因元件上来比较,内含子与外显子为甲基化水平最高的两个区域,基因下游和剪切区为这两组的甲基化水平最低的区域(图4)。

表1全基因组不同甲基化C碱基的数量及比例

2.4差异性甲基化区域分析及其关联基因分析

对照组与B[a]P染毒组在不同染色体上存在32个DMR,318个差异甲基化C碱基(differentially methylated C, DMC)(表2)。对DMR相关基因进行GO和KEGG富集分析。通过KEGG分析得到52条通路,其中11条通路显著富集(P<0.05,表3)。GO富集到871条GO条目,其中145条GO条目显著富集(P<0.05,图5)。

图2 HE染色观察大鼠海马神经细胞形态学变化

图3不同类型甲基化C分布比例

图4不同功能元件区域的甲基化水平分布

表2各染色体DMR的数目及长度分析

表3差异甲基化基因的KEGG富集分析

图5差异甲基化基因的GO分析

2.5 Tnr与Pla2g2a基因甲基化状态与mRNA的表达

根据KEGG与GO分析指标,选出代表性基因Tnr与Pla2g2进行分析。Tnr与Pla2g2a基因差异甲基化所处的功能元件分别为基因间区域与外显子区域,与对照组相比,B[a]P染毒组中Tnr基因在基因间隔区为低甲基化水平,Pla2g2a基因在外显子区域表现为高甲基化水平(表4)。与对照组相比,B[a]P染毒组大鼠海马组织中Tnr的mRNA表达降低,Pla2g2a的mRNA表达升高(P<0.05,图6)。

表4 Tnr与Pla2g2a基因的甲基化特点

图6 Tnr与Pla2g2a基因mRNA相对表达量分析

3、讨论

近年来,相关研究证明B[a]P作为一种潜在的神经毒素,可以造成神经损伤从而影响学习和记忆功能[3]。本研究通过对大鼠进行B[a]P染毒并进行Morris水迷宫实验和海马HE染色,验证了B[a]P对大鼠海马的损伤及空间学习记忆功能的影响,与本课题组之前研究结果基本一致[9]。DNA甲基化是表观遗传学最主要现象之一[10],DNA甲基化可以发生在不同染色体、不同基因区域和功能元件上,有转录抑制、DNA损伤和修复、DNA的复制与包装等功能[11]。本研究发现B[a]P染毒组甲基化C位点数量多于对照组,与WANG等[12]的研究结果一致,苯并芘暴露引起的大鼠海马甲基化异常,即在WANG等[12]的从幼年暴露和本研究从青春期开始的暴露,均可能通过表观改变调节突触可塑性,从而影响哺乳动物的认知功能。

为了更好了解B[a]P诱导的神经毒性机制,本研究对差异甲基化基因进行GO与KEGG功能富集。GO富集分析结果显示基因都直接或间接与学习记忆相关,如突触可塑性主要的表现形式为长时程增强(long-term potentiation, LTP),而LTP则是构成学习与记忆的主要分子机制之一[13];同时,GO分析也富集了钙离子转运与其通道活性的调节,YANG等[14]通过对新生大鼠进行B[a]P暴露进行研究得出:钙离子在神经传递、神经退行性病变与神经发育等神经元间的过程可能起关键作用。在KEGG分析富集到的通路中,MAPKs通路是哺乳动物中存在的重要信号转导通路,参与细胞增殖、分化、凋亡以及应激反应等生理活动过程[15],张盼盼等[16]研究得出MAPKs通路中的经典通路—ERK通路的激活会促进c-fos蛋白表达,调控海马CA1区神经元的凋亡,ERK通路也在学习、记忆功能等方面发挥关键作用[17];而在文献[18]中发现Ras信号通路与PI3K-Akt信号通路也与学习记忆功能相关,这些功能与通路都可能在B[a]P致青春期到成年阶段的大鼠海马损伤中起关键作用,但是B[a]P具体在通路中充当何种角色,还需要接下来进一步研究。

根据本研究GO与KEGG富集分析结果,筛选出代表性基因进行分析。与对照组相比,B[a]P染毒组中Tnr基因在基因间区域的甲基化水平降低,Pla2g2a基因在外显子区域的甲基化水平升高,其中Tnr mRNA表达下降,Pla2g2a mRNA表达增加。Tnr与神经系统的发育、神经元的可塑性以及神经细胞的迁移等有密切关系[19],SAGHATELYAN等[20]通过对Tnr基因敲除小鼠的研究发现:Tnr基因的缺失能够导致神经细胞外周的抑制性电流减弱,从而增加了兴奋性突触传递,并有可能最终引起了海马CA1区的LTP变异。Pla2g2a作为分泌型磷脂酶A2中的一种亚型,是一种广泛的促炎症因子[21],能够诱导神经元的凋亡并与神经退行性病变相关[22]。由此,我们推测甲基化所致的基因表达水平改变可能是B[a]P导致青春期到成年大鼠海马组织神经毒性的原因之一。

RRBS虽是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法,但仍有它的局限性[23],本研究发现的基因甲基化位点、基因表达水平和相应功能元件的表达情况仍然需要多种方法联合验证。从表观遗传学方面深入探讨B[a]P对大鼠海马的损伤机制,有望为未来研究B[a]P导致神经功能损伤的原因提供新的思路。

参考文献：

[2]代文娟,黄海燕,胡恭华.苯并芘致肺癌的研究进展[J].毒理学杂志,2018,32(6):489-493.

[4]曹家雪,张红平,杜立新.环境因素对DNA甲基化的影响[J].遗传,2013,35(7):839-846.

[5]金灵,张元珍.孕期外源物暴露致DNA甲基化异常与发育源性疾病的关系研究[J].中华生殖与避孕杂志,2018,38(6):521-525.

[6]鞠恩霞,李红,龙长权,等.基于神经成像技术的青少年大脑发育研究[J].心理科学进展,2010,18(6):907-913.

[8]凡时财,李承哲,裴云飞.人类基因组DNA甲基化数据分析的研究现状[J].中国科学:生命科学,2015,45(5):450-459.

[9]唐倩,夏茵茵,程淑群,等.苯并芘对大鼠记忆及谷氨酸盐受体基因表达影响[J].中国公共卫生,2011,27(7):902-903.

[10]李宁,刘紫阳,詹向红,等.长期负性情绪应激对D-gal大鼠认知功能及海马NR2B基因甲基化表达的影响[J].中国中西医结合杂志,2019,39(6):702-707.

[11]陈旭涛,万卓,韦梦影,等.大鼠BMSCs与ADSCs全基因组DNA甲基化差异分析[J].实用口腔医学杂志,2019,35(2):170-175.

[15]王一夫,刘爽.MAPKs信号通路与阿尔兹海默病的研究进展[J].世界中医药,2016,11(9):1929-1931.

[16]张盼盼,韩晓庆,李琳,等.间歇低氧大鼠细胞外信号调节激酶与认知功能变化[J].中国神经精神疾病杂志,2014,40(9):517-521.

[19]黄文辉,廖红,牛蕤,等.细胞外基质分子Tenascin-R的研究进展[J].中国药科大学学报,2007,38(4):375-379.

[21]杨武,郭薇,黄春洪.分泌型磷脂酶A2亚家族:结构与功能[J].中国生物化学与分子生物学报,2013,29(10):932-940.

[23]沈圣,屈彦纯,张军.下一代测序技术在表观遗传学研究中的重要应用及进展[J].遗传,2014,36(3):256-275.

谭强,王晶,李春林,唐萍,况桃,黄强,陈承志,蒋学君,程淑群,涂白杰,夏茵茵.苯并芘暴露大鼠海马组织的全基因组DNA甲基化差异分析[J].第三军医大学学报,2020,42(04):359-366.

基金:国家自然科学基金面上项目(81502777,81372957)