创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder,PTSD)是一种与遭遇到威胁性或灾难性心理创伤有关,并延迟出现和(或)长期持续的精神障碍[1]。汶川5·12大地震之后,Guo等[2]报道地震后两个月PTSD患病率为58.2%,8个月患病率为22.10%。相关医学研究[3]表明,有过在创伤性事件中暴露经历的人占总社区人数的36.7%～81.3%,男性和女性的PTSD终生患病率分别为5.0%、10.4%。

大量临床及实验研究[4,5,6,7,8,9,10]已证实针灸对PTSD有一定的临床疗效。本课题组前期研究[11]显示,电针对PTSD患者恐惧、抑郁等症状具有良好的改善效果,且疗效优于帕罗西汀,证实了电针治疗PTSD的临床疗效,并通过与其他针灸疗法及西药对比,确定了电针神庭、百会、双侧肾俞这一优势治疗方案,且对该疗法产生效应的可能机制进行了初步机制研究。课题组在前期研究[12]中已经证实电针可修复PTSD大鼠杏仁核、海马区的突触可塑性,且可通过上调脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)及其受体酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor,TrkB)信号通路的关键蛋白以激活该通路达到治疗目的,但对于突触可塑性及通路之间的互动机制未做进一步研究。因此,本实验延续前期研究,观察电针对大鼠杏仁核、海马BDNF-TrkB信号通路的关键蛋白环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)与突触关键蛋白结合能力的影响,为探讨杏仁核、海马脑区突触可塑性与BDNF-TrkB信号通路的互动机制寻找突破口,以进一步阐明电针治疗PTSD的作用机制。

1、材料与方法

1.1实验动物及分组

SPF级健康SD雄性大鼠24只,体质量180～220 g,由南京大学动物模式中心提供,生产许可证号:SCXK(苏)2015-0001,将大鼠随机分为空白组、模型组、电针组,每组8只。于安静环境下饲养,自由摄食饮水,自然光照,温度22～26℃。适应性饲养10 d,在此期间实验者每天抚摸大鼠5 min以使动物适应实验者的操作。整个实验过程中对动物的各种处理均遵照科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》,实验方案已得到成都中医药大学动物保护伦理委员会的批准。

1.2主要仪器和试剂

G6805-2型电针仪(上海医用电子仪器厂理疗分厂),华佗牌一次性针灸针(0.25 mm×25 mm),DigBehv-LR自发活动视频分析系统(上海吉量软件科技),Berthold多功能酶标仪(美国Thermo),0412-1型离心机(德国Eppendorf),半干式转膜槽,垂直蛋白电泳仪(美国Bio-Rad),化学发光成像系统(美国GE),BS210S电子天平(德国Satrious),超声破碎仪Bioruptor pico(比利时Diagenode), CHIP-IT Kit(美国Active Motif),徕卡轮转式切片机(德国徕卡);蛋白定量试剂盒、蛋白提取试剂盒(碧云天)、鼠Synaptophysin抗体[SY38]、磷酸化CREB抗体(英国Abcam),凝胶回收试剂盒D2500-01(美国OMEGA)。

1.3大鼠PTSD模型的建立

采用国际公认的SPS法造模,应激刺激由心理应激(束缚应激)和生理应激(强迫游泳、乙醚麻醉)构成[13,14]。处理步骤如下:①禁锢:将大鼠头朝瓶嘴、尾露外面塞入塑料瓶中,并用透明胶带捆紧后水平放置2 h;②强迫游泳:将禁锢后的大鼠放入水深约30 cm、水温(24±2)℃的矩形水槽中强迫游泳20 min;③乙醚麻醉:强迫游泳后将大鼠捞回饲养笼中,15 min后放入乙醚缸内麻醉至意识丧失。以上4种刺激方式各刺激1次,1天内完成。

1.4电针治疗方法

造模后第14天,电针组选“百会”“神庭”“肾俞”进行针刺,参照《实验针灸学》[15]并结合比较解剖学方法进行大鼠穴位定位。针尖向后斜刺“神庭”及“百会”2 mm,“肾俞”直刺8 mm。“神庭”、左“肾俞”为一组,“神庭”接电针仪正极,左侧“肾俞”接电针仪负极;“百会”、右“肾俞”为一组,“百会”接电针仪正极,右“肾俞”接电针仪负极。频率为2 Hz/100 Hz,疏密波,强度为1 mA,每日1次,每次20 min,连续治疗21 d。空白组和模型组大鼠均不做电针刺激。

1.5观察指标及检测方法

自发活动检测:电针治疗结束后第2天对各组大鼠进行自发活动检测,将大鼠从鼠笼放入自发活动检测箱(40 cm×40 cm×50 cm)内,自由探究30 min后取出大鼠放回鼠笼。由视频跟踪系统记录分析大鼠水平活动距离,以5 min为1个block分别记录6个block期间大鼠水平活动距离。

条件性恐惧反应检测:自发活动检测结束后,开始条件性恐惧反应检测。自制条件性恐惧反应检测试验箱:四方体箱,无顶,尺寸为40 cm×40 cm×50 cm,箱体材料为有机玻璃,黑色不透明,底面由25根铜杆组成,铜杆直径为0.5 cm,间距为1.5 cm,铜杆与电刺激器通过导线连接。四壁由白色圆形间隔图案组成,竖条宽为3 cm,间距为2.5 cm。实验分为7 d进行,第1天为习惯化训练,将大鼠放入实验箱自由探究10 min后放回鼠笼;第2天为恐惧条件化训练,给予声刺激(4 kHz,80 dB,20 s)与足底电刺激(0.5 mA,0.5 s)交替刺激,共5次,两种随机训练的间隔时间为60～120 s,平均90 s;第3天开始为恐惧消退训练,持续3 d,单独给予16次声刺激,参数同上,每次声刺激的间隔为60～120 s,平均90 s;第6天为消退检测,同样给予大鼠16次声刺激,参数同上;第7天为重建检测,单独给予10次声刺激,参数同上,最后一次声刺激后30 s将大鼠取出放回鼠笼。30 min后,将大鼠重新放回试验箱,单独给予2次足底电刺激(0.5 mA,0.5 s),间隔60 s,电刺激后单独给予10次声刺激(4 kHz,80 dB,60 s),每次声刺激的间隔为60～120 s,平均90 s。因为刺激会诱发大鼠产生非特异性僵直反应(除呼吸相关运动外无其他运动的状态,是啮齿类动物面对伤害性刺激的防御反应),每次刺激结束后实验人员快速、准确捕捉大鼠的僵直反应,观察时间20 min,每120 s为1个block。为排除非特异性僵直反应对电针作用的干扰,把恐惧条件化训练阶段中第1次刺激呈现的前19.5 s内的大鼠僵直时间百分比作为大鼠僵直时间百分比的基线水平。分别记录恐惧条件化训练阶段、恐惧消退训练阶段和重建检测阶段声刺激(线索)诱发的大鼠僵直时间百分比。

免疫组织化学法检测杏仁核、海马CREB磷酸化水平的表达:条件性恐惧反应检测结束后,每组取3只大鼠用7%水合氯醛腹腔注射麻醉,固定大鼠四肢于一木板上,打开胸腔和腹腔,进行心脏灌注,用约250 mL 0.1 mol/L PB缓冲液冲洗血液,5%戊二醛固定液500 mL灌注固定。灌注结束后,取出脑组织,在脑模具上将脑组织进行大体分区后,利用体视显微镜进行精确分区(杏仁核、海马脑区),将组织块修成体积1 mm×1 mm×3 mm大小,并放入3%多聚甲醛固定液中,过夜,后固定。检测前制备石蜡切片,厚度4μm。制备好的的组织石蜡切片进行脱蜡、脱水、胰酶热修复、山羊血清封闭后,按一定比例稀释兔抗磷酸化CREB抗体(1∶100),4℃冰箱过夜;次日滴加二抗(1∶100)室温孵育,PBS洗涤;DAB显色,显微镜下控制反应时间,苏木素复染,脱水,树胶封片;使用相差显微镜200倍视野下随机选取3个区域拍照,Image-Pro Plus 6.0进行图像分析。

检测杏仁核、海马磷酸化CREB的表达:每组3只大鼠,剥离大脑皮层后取出杏仁核、海马,截取部分杏仁核、海马组织分别剪碎,用蛋白裂解液裂解提取蛋白,通过BCA法进行蛋白定量;进行SDS-PAGE电泳、恒压转膜、染膜,随后TBST清洗、封闭;用TBST稀释至适当浓度(1∶100～1∶400)的鼠Synap-tophysin抗体(一抗)4℃过夜,次日加入适量适当浓度的抗IgG抗体(二抗),室温孵育;ECL发光试剂曝光、显影,用GE发光成像工作站进行图像采集。

CHIP检测杏仁核、海马中CREB与突触关键蛋白的结合能力:组织单细胞悬液制备方法:将组织剪碎后放入研磨器研至匀浆,加入10 mL 0.9%氯化钠溶液冲洗研磨器,收获细胞悬液,并经200目尼龙网过滤,1 500 r/min离心5 min。第1天:取组织单细胞悬液,加入243μL 37%甲醛固定细胞→收集细胞,超声破碎或酶解法破碎细胞→加入目的蛋白的抗体,与超声后的靶蛋白-DNA复合物相互结合,过夜孵育;第2～3天:加入Protein A Agarose,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀→对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合→洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物→解交联→纯化富集的DNA-片断→qPCR分析。

1.6统计学分析

应用统计软件SPSS20.0进行统计学分析,数据结果用均数±标准差(x−±s)表示。多组比较采用单因素方差分析,进一步两两比较时,符合正态分布且方差齐性要求,采用LSD检验,数据不符合正态分布或者方差不齐,采用Tamhane’s T2检验。以P≤0.05为差异有统计学意义的标准。

2、结果

2.1各组大鼠自发活动状况比较

由图1可知,模型组大鼠水平活动距离明显短于空白组(P<0.01),电针组大鼠水平活动距离显著长于模型组(P<0.05)。

2.2各组大鼠条件性恐惧反应比较

由图2可知,在恐惧条件化训练阶段(A),各组大鼠在block 1—4期间僵直时间百分比差异无统计学意义(P>0.05),在block 5中模型组大鼠僵直时间百分比显著高于空白组(P<0.01),而电针组大鼠的僵直时间百分比显著低于模型组(P<0.01);在消退训练阶段(B—D),模型组僵直时间百分比明显高于空白组(P<0.01),电针组僵直时间百分比显著低于模型组(P<0.01);在重建检测阶段(E),除block 8、block 10,其余各时间段,模型组僵直时间百分比高于空白组,电针组大鼠僵直时间百分比显著低于模型组(P<0.01,P<0.05)。

图1各组大鼠自发活动距离比较(x-±s,8只鼠/组)

2.3各组大鼠杏仁核、海马脑区磷酸化CREB阳性表达的比较

由图3可知,与空白组比较,模型组磷酸化CREB阳性表达显著下调(P<0.01);与模型组比较,电针治疗能够显著上调磷酸化CREB的阳性表达(P<0.01)。

2.4各组大鼠杏仁核、海马区磷酸化CREB相对表达量的比较

由图4可知,与空白组比较,模型组杏仁核、海马组织中磷酸化CREB表达量显著下调(P<0.01),与模型组对比,电针组磷酸化CREB表达量显著上调(P<0.01)。

图2各组大鼠在恐惧条件反应检测中不同阶段的僵直时间百分比的比较(x-±s,8只鼠/组)

图3各组大鼠杏仁核、海马区磷酸化CREB阳性表达的比较(免疫组织化学法,×200,x-±s,3只鼠/组)

2.5各组大鼠杏仁核、海马CREB与突触关键蛋白SYN、GAP43、PSD95启动子区的结合能力的比较

由图5可知,在杏仁核脑区各组CREB与SYN、GAP43启动子区的结合能力差异无统计学意义(P>0.05)。与空白组比较,模型组的CREB与PSD95启动子区的结合能力显著下调(P<0.01),与模型组比较,电针组能显著上调CREB与PSD 95结合能力(P<0.05);图6可知,在海马脑区各组CREB与SYN和GAP43启动子区的结合能力差异无统计学意义(P>0.05)。与空白组比较,模型组的CREB与PSD95启动子区的结合能力显著下调(P<0.01);与模型组比较,电针组能显著上调CREB与PSD95结合能力(P<0.05)。

3、讨论

从病因病机和以易惊易恐为核心的临床表现来看,PTSD主要与肾、脑关系最为密切。如《素问·举痛论》曰“恐则气下”“恐惧不解则伤精,精伤则骨酸痿厥,精时自下”“恐则精却”[16]16]。此外,《素问·生气通天论》中“阴者藏精而起亟也,阳者卫外而为固也”的论述,认为“起亟”类似于现代医学中的应激反应[17]17]。研究[18]18]表明,PTSD患者存在大脑结构和功能的异常改变,这也是该病与脑密切相关的依据之一。基于以上论点和多年临床实践,本研究团队前期的多中心、大样本的随机试验证实,相比其他针灸治疗方法,醒脑调肾电针法治疗PTSD疗效优于单纯使用西药[11]11]。前期神经影像学研究[19,20,21]19-21]显示该疗法可调整脑功能、改善葡萄糖代谢率等。其他相关研究[12,22,23]12, 22-23]也证实,该疗法可改善PTSD模型大鼠杏仁核、海马中关键物质的表达及以上脑区的突触可塑性。

图4各组大鼠杏仁核、海马区磷酸化CREB相对表达量的比较(x-±s,3只鼠/组)

图5各组大鼠杏仁核区CREB与突触关键蛋白SYN、GAP43、PSD95启动子区的结合能力的比较(x-±s,3只鼠/组)

图6各组大鼠海马区CREB与突触关键蛋白SYN、GAP43、PSD95启动子区的结合能力的比较(x-±s,3只鼠/组)

PTSD发病的核心和治疗难点是恐惧记忆的持续存在,而恐惧记忆的获得、储存、提取、再巩固和消退过程本质上可能与脑内核团的神经环路有关,而杏仁核、海马被认为是与其最密切相关的脑区[24,25]24-25]。因此修复受损的杏仁核和海马成为治疗PTSD的核心所在。突触可塑性是学习和记忆的基础,参与恐惧记忆的获取、储存和消退,因此调控杏仁核、海马突触可塑性成为目前研究神志疾病治疗的热门切入点,不少研究从分子和基因的层面深入探讨了针刺对突触可塑性的影响机制,结果提示针刺可能通过修复关键脑区神经元,影响神经递质-受体、神经营养、能量代谢、细胞黏附和其他突触可塑性相关蛋白等,促进神经元突触可塑性发挥作用[26,27,28,29]26-29]。同时,针刺调节突触结构修复与突触功能的机制也是目前的研究热点之一[30,31]30-31]。在针刺调控信号通路治疗PTSD方面,BDNF-TrkB信号通路是近年来研究热点,研究发现,PTSD患者外周血中BDNF的浓度降低,提高BDNF水平可有效改善PTSD症状,也有研究[32]32]证实BDNF-TrkB信号通路的变化有助于不同功能的脑区同时发挥作用,以促进恐惧记忆的消退,BDNF-TrkB介导的信号通路的激活,启动BDNF的表达,是恐惧记忆消退的基础[33]33]。BDNF-TrkB信号通路与突触可塑性又有密切的联系,有研究[34]34]表明急性应激会使海马的BDNF及其受体TrkB的表达水平发生改变,而这种改变和海马神经突触的可塑性和功能密切相关;BDNF通过调控N-甲基-D-天冬氨酸受体作用于不同信号通路参与突触可塑性损伤的病理生理过程,在抑郁模型大鼠的研究中发现BDNF蛋白表达减少影响了PSD95和SYN等突触相关蛋白的表达,从而导致杏仁核和前额叶皮质发生神经突触结构可塑性变化。

本团队前期研究已经证实针刺对杏仁核、海马突触可塑性的修复机制以及对BDNF-TrkB信号通路的激活作用,本研究对突触可塑性及BDNF-TrkB信号通路的交互机制进行初步探讨,发现PTSD模型大鼠杏仁核、海马脑区中BDNF-TrkB信号通路的下游效应蛋白CREB的表达明显降低,其与突触关键蛋白PSD95的结合能力明显下降,电针可提高CREB的表达,促进CREB与PSD95的结合能力。这可能是突触可塑性与BDNF-TrkB信号通路发生交互作用的切入点,也可能是针刺治疗PTSD的关键机制。但由于影响交互作用的因素众多,电针干预的机制还需进一步探究。

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基金:国家自然科学基金面上项目(No.81574086);海南省自然科学基金青年项目(No.819QN223)