实验动物穴位的选择对针灸实验研究影响较大,需要依据规范的穴位定位标准[1]。20世纪90年代建立的动物穴位定位行业标准[2]为探讨针灸作用机制起到了极大的推动作用。家兔体表面积大,穴位空间特异性研究较鼠更好,较大的身体体积和便宜的价格使其成为常用的针灸经络实验的模式生物[3]。但通过近30年的使用发现,行业标准中家兔穴位定位数量过少,准确性不高,制约了针灸实验工作的开展[4]。

手少阳三焦经的五输穴和原穴在临床上应用广泛[5,6,7,8,9,10],但因现有资料中仅有家兔“关冲”的定位[11,12,13],用其复制疾病模型后无法开展其他相关穴位的作用机制研究。本课题组采用人体国家标准中定位与表述的方法[14,15],对家兔手少阳三焦经“关冲”“液门”“中渚”“阳池”“支沟”“天井”进行定位,为家兔穴位定位、取穴及穴区结构提供解剖学资料,初步探索家兔穴位定位标准化方法。

1、材料与方法

1.1实验动物与分组

普通级新西兰兔20只,雌雄各半,体质量2.6～3kg,4月龄,购自贵州医科大学实验动物中心,生产许可证号:SCXK(黔)2018-0001。实验前适应性饲养3d,室温(22±4)℃,相对湿度52%～72%。通风良好,自然照明,家兔自由摄食饮水。实验中对动物的处理符合中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

采用随机数字表法将家兔分为2组:(1)第1组10只:麻醉后拍摄X线片,比拟人体对家兔穴位定位(第1次定位),解剖定位区域,对比两者差异,校正定位(第2次定位)。(2)第2组10只:在第2次定位的基础上解剖观测穴区。

1.2主要仪器及试剂

SOM2000D手术显微镜(苏州六六视觉公司),SSW-1显微外科器械包[上海医疗器械(集团)有限公司手术器械厂],MarCal16EWR游标卡尺(德国马尔),一次性无菌针灸针(0.16mm×13mm,苏州针灸用品有限公司)。

水合氯醛(上海BBI生命科学有限公司),邻苯二甲酸二丁酯、乙酸乙酯(天津市致远化学试剂有限公司),枸橼酸钠(重庆茂业化学试剂有限公司),ABS塑料(镇江奇美化工有限公司),蓝、红色油画颜料(上海实业马利画材有限公司)。

1.3穴位定位方法

第1次定位:将第1组家兔用10%水合氯醛(3.5mL/kg)腹腔注射麻醉后拍摄X线片。以人体腧穴中国国家标准GB/T12346-2006《腧穴名称与定位》[15](以下简称国标)和WHO标准《世界卫生组织标准针灸经穴定位(西太平洋地区)》[16](以下简称WHO标准)为依据,参照中国国家标准GB/T22103-2008《腧穴定位图》[17](以下简称国标定位图),结合体表标志、影像学结果确定家兔穴区定位、取穴所需的体表标志与体位。再次麻醉家兔(方法同上),对前肢剃毛后,运用表面解剖学方法进行人与家兔体表标志、体位比较,确定并标记穴区的位置。

第2次定位:空气栓塞法处死麻醉后的第1组家兔,将踝关节与膝关节置于取穴法所要求的体位。按临床进针方向针刺标记处,采用课题组前期方法进行层次解剖[18,19]。基于比较解剖学原理与方法[20,21],将针灸针毗邻的骨、骨骼肌、神经和血管与人体穴区相关结构[22,23]进行比较,进一步校正穴位定位的位置。

1.4穴区解剖、观测

于第2组家兔标记的第2次定位穴位位置,进行血管灌注与解剖测量。方法参照前期工作[18,19]略有改进。

灌注液制备:将20gABS塑料完全溶于95mL乙酸乙酯后,加入5mL的邻苯二甲酸二辛酯,将该溶液加入适量乙酸乙酯稀释,最终得到浓度分别为5%、10%和20%的ABS灌注液。在20%ABS灌注液中加入适量红色油画颜料,5%、10%、20%的ABS灌注液中加入蓝色油画颜料,搅拌均匀后待用。

耳缘静脉注射10%水合氯醛(6mL/kg)麻醉、处死家兔。前肢剃毛,解剖出锁骨下动、静脉及腋动脉。先行剪开锁骨下静脉,在锁骨下动脉注入5%的柠檬酸钠溶液冲洗血管,血液基本冲出后用止血钳夹闭锁骨下静脉。再向锁骨下动脉继续注入5%柠檬酸钠溶液,血管充盈后夹闭锁骨下动脉,静置20min,松开止血钳,反复用5%柠檬酸钠溶液冲洗血管至冲洗液澄清。从腋动脉处缓慢注入蓝色ABS灌注液,以5%、10%、20%的浓度依次灌注,每次灌注量5～7mL,以充满前肢动、静脉为限。再于同样部位注入20%的红色灌注液,灌注量略少于前肢动、静脉总容量的一半,将蓝色灌注液挤入静脉。仔细观察家兔指端血管,在红色灌注液距离指末端1cm左右时停止灌注,保持压力直至红色灌注液到达指尖,按体位要求放入-20℃的冰箱24～48h待其灌注液凝固。常温解冻后将针灸针按临床进针方向刺入穴位,穴位旁做十字形切口,保留穴区皮肤与周围皮肤的联系,进行逐层解剖。在显微镜下观察并测量针灸针与穴区肌肉、血管、神经的距离。每个数据测量3次,取平均值,读数精确到10-5m。

1.5定位法、取穴法的表述

穴位定位法、取穴法的表述方式以人WHO标准和国标作为模板,参照国标编制说明[24]。定位表述采用“Y轴与X轴两线相交于一点”。取穴法是对于定位的一种阐释[25],先明确体位,再用解剖标志取穴,必要时结合骨度分寸法,表述方式根据具体情况可以与定位法相同。

1.6统计学处理

使用SPSS24.0软件进行数据分析,GraphPadPrism5进行图形制作。计量资料采用均数±标准差(x−±s)表示,符合正态分布,左右肢数据比较用配对t检验。以P≤0.05为差异有统计学意义的标准。

2、结果

2.1家兔前肢骨性标志与骨度分寸X线成像

近侧列腕骨4块,由外向内分别是副腕骨、尺腕骨、中间腕骨、桡腕骨。副腕骨(相当于人豌豆骨)是1块籽骨,位于尺腕骨掌侧面,与尺腕骨形成关节。肘尖发达,呈方形向后凸起。按照人体骨度分寸标准,副腕骨与肱骨外侧髁的距离为12寸。见图1。

2.2穴位定位、取穴、针刺层次及毗邻结构

2.2.1“关冲”

(1)定位法:

在前足指第4指末节外侧,爪甲根角侧后方1×10-3m处。见图1、图2、图3、图4。

(2)取穴法:

远节指关节180°时,第4爪甲外侧缘延长线与爪甲基底缘延长线的交点。见图1、图2、图3、图4。

(3)针刺层次:

由浅入深为皮肤、浅筋膜、深筋膜、第4爪甲廓深面的甲根。见图4。

(4)毗邻结构:

指深屈肌腱、第4指背侧远轴侧动脉、第4指掌侧远轴侧动脉与第4指背侧远轴侧静脉之间的毛细血管网、第4指掌侧远轴侧神经末梢。动脉、静脉与神经末端成分支呈网状,本实验仅测量肉眼可见末端,数据仅供参考。指深屈肌肌腱在中节指骨掌面处从指浅屈肌肌腱间穿出,终止于末节指骨。针灸针位于指浅屈肌肌腱外上方。左右肢针灸针与肌肉、血管和神经的距离比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图4、图5。

图1家兔前肢骨性标志与骨度分寸X线成像

2.2.2“液门”

(1)定位法:

在前足背第4、5指间,指蹼缘上方背毛交界处凹陷中。见图1、图2、图3、图6。

(2)取穴法:

前肢第4、5指间,指蹼缘上方背毛交界处凹陷中。见图1、图2、图3、图6。

(3)针刺层次:

由浅入深为皮肤、浅筋膜、深筋膜、蚓状肌。见图6、图7。

(4)毗邻结构:

第4、5指骨间肌、第4掌背动脉、第4掌背静脉、第4指背侧远轴侧神经、第5指背侧轴侧神经。第4掌背动脉在掌指关节前方分为第4指掌侧远轴侧动脉和第5指掌侧轴侧动脉,家兔4、5指间隙小,针灸针与掌背动脉、指背动脉都较接近,同名静脉与动脉伴行,本实验仅测量针灸针与掌背动脉分支处的距离。针灸针于第4掌背动脉分支点附近进入穴区。20例中有2例贴着第4掌背动脉分支点,占10%;有4例刺中蚓状肌;其余紧贴蚓状肌外侧面。左右肢针灸针与肌肉、血管和神经的距离比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图5、图6。

2.2.3“中渚”

(1)定位法:

在前足背第4、5掌骨间,第4掌骨头掌骨体交界处。见图1、图2、图3、图6。

(2)取穴法:

家兔第4、5掌骨间,第4掌指关节近端凹陷处。见图1、图2、图3、图6。

(3)针刺层次:

由浅入深为皮肤、浅筋膜、深筋膜、蚓状肌。见图6、图8。

(4)毗邻结构:

第4、5指骨间肌、第4掌背动脉、第4掌背静脉、第4指背侧远轴侧神经、第5指背侧轴侧神经。掌背动脉的分支点在第5掌指关节远端,第4掌指关节附近。本实验测量针灸针与分支点距离,并统计在分支点近端与远端的比例。20例中刺中掌背动脉分支点有4例,占20%;3例针灸针位于分支点远端,占15%;13例针灸针位于分支点近端,占65%。左右肢针灸针与肌肉、血管和神经的距离比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图5、图6。

2.2.4“阳池”

(1)定位法:

在腕背侧,副腕骨与桡腕骨在体表连线与指总伸肌尺侧缘凹陷相交处。见图1、图2、图3、图6。

(2)取穴法:

腕关节180°时,副腕骨与桡腕骨在体表连线与指总伸肌尺侧缘凹陷相交处。见图1、图2、图3、图6。

(3)针刺层次:

由浅入深为皮肤、浅筋膜、深筋膜、指总伸肌腱尺侧。见图6、图9。

(4)毗邻结构:

指总伸肌、腕背静脉。针灸针全部贴近指总伸肌腱,占100%。左右肢针灸针与肌肉、血管距离比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图5、图6。

2.2.5“支沟”

(1)定位法:

在前臂后侧,腕背侧远端横纹上3寸,尺骨与桡骨间隙中。见图1、图2、图3、图6。

(2)取穴法:

腕背侧远端横纹上3寸,尺骨外侧与桡骨内侧连线中点。见图1、图2、图3、图6。

(3)针刺层次:

由浅入深为皮肤、浅筋膜、深筋膜、指总伸肌。见图6、图10。

(4)毗邻结构:

指总伸肌、骨间后动脉分支、头静脉。针灸针全部刺中指总伸肌。左右肢针灸针与肌肉、血管距离比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图5、图6。

2.2.6“天井”

(1)定位法:

在肘后侧鹰嘴尖直上,横平肱骨体与肱骨外侧髁交界处。见图1、图2、图11。

(2)取穴法:

屈肘90°时,鹰嘴窝中。见图1、图2、图11。

(3)针刺层次:

由浅入深为皮肤、浅筋膜、深筋膜、肱三头肌。见图11、图12。

(4)毗邻结构:

肱三头肌、尺侧副动脉、尺侧副静脉。肱三头肌内侧头覆盖鹰嘴窝,针灸针20例均刺中肱三头肌。尺侧副动脉由臂(肱)动脉发出,不下行前臂,仅分布于肱三头肌与肘肌,尺侧副静脉与同名动脉伴行。6例刺中尺侧副动脉,占30%;7例刺中尺侧副静脉,占35%。左右肢针灸针与肌肉、血管距离比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图5、图11。

图2家兔前肢体表标志、骨度分寸及穴位定位

3、讨论

2006版国标引入表面解剖学、影像学、人体测量学,综合多种技术解决了诸多人体腧穴定位难题,提高了定位精度[14]14]。本研究应用相同的方法,并结合人与家兔比较解剖学结果,对家兔三焦经五输穴、原穴进行定位、取穴,确定了“关冲”“液门”“中渚”“阳池”“支沟”“天井”6穴位置,初步验证了可通过人国标定位的方法进行动物穴位定位标准化研究。既往文献[11,12]11-12]在描述家兔穴位位置时仅有定位法,本研究参照国标将家兔穴位定位法与取穴法分开表述,定位法用解剖学术语表述,取穴法按针灸教学中“点穴”文本,明确体位,尽可能对定位用俗语解释,解决了传统动物穴位定位中缺少体位描述的问题[1]1]。如与文献[11]“关冲”的定位比较,本研究明确了自甲根角旁开的方向,提高了定位的精度,“关冲”定位与取穴位置的相互验证,更可提高穴位定位的精准性与可重复性。

图3家兔前肢骨性标志、骨度分寸及穴位定位

家兔前臂生理状态为旋前位,尺、桡骨位置与人体解剖学姿势相反,因此部分起止点在尺、桡骨的肌肉与人差别较大。此外家兔为跖、趾行性行走,生理状态下掌指关节角度略大于180°,导致掌、指位置的肌肉也与人不同。这两个因素造成了除“天井”与“关冲”穴区外,家兔其他4个穴位处的肌肉与人均有不同程度的差异。人的支沟穴区深面为小指伸肌、拇长伸肌,内侧为指伸肌[22]22],阳池为指伸肌、小指伸肌。家兔拇长伸肌退化,指总伸肌(相当于人指伸肌)及第5指固有伸肌(相当于人小指伸肌)向外侧移动,导致这两穴针刺时刺中的肌肉人与家兔差异较大。人的中渚、液门穴区深面为骨间背侧肌与蚓状肌[22,23]22-23],家兔此处肌肉细小,刺穿深筋膜后即为蚓状肌,骨间肌位于两侧,与针不接触。

图4“关冲”解剖结构

图5家兔左右肢各穴针灸针与穴区毗邻肌肉、血管、神经距离的比较

图6“液门”“中渚”“阳池”“支沟”解剖结构

图7“液门”矢状面断层组织结构

图8“中渚”横断面断层组织结构

图9“阳池”横断面断层组织结构

图10“支沟”横断面断层组织结构

图11“天井”解剖结构

图12“天井”横断面断层组织结构

家兔前肢少阳经五输穴、原穴穴区处的动脉均是臂动脉(相当于人肱动脉)的各级分支。臂动脉在肘窝内侧上方发出尺侧副动脉,后者营养“天井”穴区。臂动脉下行在前臂近端发出骨间总动脉,骨间总动脉又发出骨间后动脉,后者走行在前臂远端及腕部浅表,主干离“支沟”“阳池”穴区较远,仅发出细小分支营养两穴。骨间后动脉最后与桡动脉背支形成前足背动脉网,发出指背动脉走行“中渚”“液门”穴区,终支在“关冲”处分散为毛细血管网。总体而言,家兔与人穴区动脉位置走行近似,但在每一个穴位上并不是肱动脉同一级分支,属于肱动脉不同层级的分支。除“天井”外,家兔其余5个穴位均比人低1到2级分支。穴区处的静脉分为深、浅两类,深静脉与同名动脉伴行,浅静脉走行在皮下,为头静脉及属支。“关冲”穴区皮下组织少而致密,无浅静脉,“中渚”“液门”穴区浅静脉汇入前足背静脉网后构成头静脉起点,“阳池”穴区有头静脉的属支腕背静脉,走行位置及分支变异较大,“支沟”穴区有头静脉属支汇入,“天井”穴区未见头静脉及属支。总之,家兔穴区浅层血管以头静脉及属支为基础,深层血管以臂动、静脉及分支为基础。

家兔浅层穴区“天井”有臂内侧皮神经分布,“支沟”“阳池”分别有桡、尺神经皮支分布,“中渚”“液门”有桡、尺神经皮支共同分布,“关冲”有尺神经末梢分布。深层穴区中“天井”“支沟”“阳池”均有桡神经分支分布,“中渚”“液门”“关冲”均有尺神经分布。家兔浅层神经分布与人略有不同,深层与人一致[22,23]22-23],向上追溯,人与家兔神经纤维均主要来自第5—8颈神经及第1胸神经[26]26]。总体来看,家兔穴区浅层以尺、桡神经皮支和臂内侧皮神经为基础,深层以尺、桡神经分支为基础。

值得注意的是即使家兔与人穴位表面解剖一致,但在比较解剖学中穴区深面组织结构并不一致。综合考察两者6个穴位肌肉、血管与神经同源关系,“阳池”“支沟”穴区比较解剖学差异较大,“液门”“中渚”差异较小,“关冲”“天井”与人最为接近。因此,穴位特异性研究必须考虑到人与家兔穴区解剖学的差别。

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基金:贵州省科学技术项目(黔科合J字【2013】2065号)