原发性痛经(primary dysmenorrhea, PD)是一种盆腔脏器无器质性病变的常见妇科疾病,以行经期或行经前剧烈下腹部疼痛并时常伴随腰背疼痛、恶心、呕吐和腹泻为主要临床症状,严重影响患者的工作和生活[1]。目前认为子宫内膜中的前列腺素(prostaglandin, PG)等因子增多是PD发生的关键原因,其中的PGF2α作用于子宫平滑肌和血管引起痉挛性收缩,继而引起子宫缺血缺氧而产生疼痛[2]。环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)是调节PG的关键因子,在生理情况下细胞中COX-2含量极低,但当机体发生病理损伤时,刺激机体生成COX-2,进而催化花生四烯酸转换为PG,促进组织合成和释放大量PG[3,4]。COX-2的生成又受到核转录因子κB (nuclear factor kappa B, NF-κB)的调控,当机体受到刺激后,NF-κB被磷酸化激活并转位入核调控COX-2的转录表达[5]。NF-κB、COX-2和PGF2α在PD发生发展中发挥了重要作用[6]。

临床研究表明,穴位埋线干预PD疗效确切[7],可通过调控PGF2α的水平,缓解PD患者因子宫痉挛缺血所导致的疼痛[8]。前期研究[9]揭示穴位埋线可明显改善PD大鼠疼痛症状和病理损伤情况,但目前穴位埋线调控PD中PGF2α水平的具体机制还不明确。本实验通过建立PD大鼠模型,观察穴位埋线对大鼠子宫组织中NF-κB、COX-2和PGF2α的影响,探讨穴位埋线治疗PD的机制。

1、材料与方法

1.1实验动物与分组

SPF级健康成年雌性SD大鼠40只,体质量220～250 g,2～3月龄,由湖南中医药大学动物实验中心提供,许可证号:SYXK(湘) 2013-0005。实验前动物适应性喂养1周,室温20～25℃,自然昼夜节律光照,自由进水摄食。将大鼠随机分为正常组、模型组、穴位埋线组、西药组,每组10只。实验过程中动物的处置均遵循2006年中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2主要仪器及试剂

TGL20M台式高速冷冻离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司),BioTek Cytation 5细胞成像多功能酶标仪(美国伯腾仪器有限公司),电泳仪、转膜仪、凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司),可吸收胶原蛋白线(山东博达医疗有限公司),7号埋线针(扬州市江洲医疗器械有限公司)。

布洛芬(中美天津史克制药有限公司),苯甲酸雌二醇(广州白云山明兴制药有限公司),缩宫素(生工生物工程股份有限公司),RIPA裂解液、超敏ECL化学发光试剂盒、PVDF膜(上海碧云天公司),蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂(美国Bimake),BCA蛋白定量试剂盒(美国Thermo),NF-κB p65抗体、phospho-NF-κB p65抗体、COX-2抗体(美国Cell Signaling Technology),山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗(德国Merck Millipore),PGF2αELISA检测试剂盒(美国Cayman Chemical),水合氯醛(中国梯希爱化成工业发展有限公司)。

1.3造模方法

参照前期研究[9]采用苯甲酸雌二醇联合缩宫素制备PD大鼠模型:于右侧股部皮下注射苯甲酸雌二醇(1 mg/mL),第1天注射0.5 mL/只,第2～9天注射0.2 mL/只,第10天注射0.5 mL/只。第11天腹腔注射缩宫素(0.9%氯化钠溶液配置,浓度为50 mg/100 mL,即5 U/mL)2 U/只。以注射缩宫素后大鼠出现扭体反应为造模成功的标准[10]。

正常组大鼠于相同时间右侧股部皮下注射等量0.9%氯化钠溶液,连续注射10 d,每天1次,第11天腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液。

1.4治疗方法

穴位埋线组:将大鼠固定于自制的束鼠布套内,对双侧“三阴交”和“关元”穴进行埋线,取穴参照《实验针灸学》[11]。“三阴交”位于后肢内踝尖直上10 mm处;“关元”位于脐下25 mm处,脐定位于胸锁联合和耻骨联合下1/4与上3/4交点处。常规消毒后,将长0.5 cm的胶原蛋白线由针尖放入7号埋线针内,左手定位穴位并按压,以利于得气,右手执持针器,于相应穴位垂直进针,“三阴交”直刺5 mm,“关元”直刺2 mm,边推针芯边退针管,将胶原蛋白线埋入穴位内。于造模第1天及造模第5天,进行穴位埋线治疗。

西药组:于造模第1天开始予布洛芬(0.9%氯化钠溶液配置,浓度为125 mg/100 mL)灌胃,每只0.8 mL,连续给药10 d。

正常组与模型组仅给予和其他2组同样的抓取、固定。

1.5观察指标及检测方法

扭体次数的测定:于第11天,各组大鼠腹腔注射2 U缩宫素后,观察记录30 min内各组10只大鼠扭体反应发生次数。扭体反应标准:大鼠腹部内凹,躯干与后肢伸展,一侧肢体内旋。

取材:扭体次数测定结束后,将大鼠以10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉,在冰盘上迅速取出子宫组织,-80℃冻存用于后期检测。

ELISA法检测子宫组织中PGF2α含量:每组随机抽取5只大鼠的冻存子宫组织,称取同侧同位段子宫组织100 mg,进行组织匀浆,4℃12 000 r/min离心10 min,取上清。参照说明书配制稀释液和标准品液,加样后4℃孵育过夜,洗板后加入Ellman’s Reagent试剂并在4℃暗处反应60 min,于412 nm处测定各孔吸光度值。以标准孔吸光度值及其对应浓度绘制标准曲线,计算各组大鼠样本子宫组织中PGF2α的含量。

Western blot法检测子宫组织中COX-2、phospho-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白表达:各组取剩余5只大鼠同侧同位段子宫组织100 mg,加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂各10μL的裂解液1 mL,冰上裂解10 min,匀浆后4℃12 000 r/min离心10 min,取出含有组织总蛋白的上清液,加上样缓冲液后于沸水浴加热10 min,以充分变性蛋白。根据BCA蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量,绘制标准曲线,计算蛋白浓度并进行配平。电泳、转膜、封闭。将膜与phospho-NF-κB p65 (1∶1 000)、NF-κB p65 (1∶1 000)、COX-2 (1∶1 000)和β-actin (1∶5 000)抗体4℃孵育过夜;TBST缓冲液洗膜,加二抗(1∶10 000)与膜于室温摇床孵育60 min。ECL显色曝光,采用Quantity One灰度分析软件进行分析,以β-actin为内参蛋白,以目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.6统计学处理

采用SPSS17.0软件进行统计学处理。计量资料均服从正态分布,以均数±标准差(x−±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较方差齐时采用LSD检验,方差不齐时采用Dunnett-t检验。以P≤0.05为差异有统计学意义的标准。

2、结果

2.1各组大鼠扭体次数的比较

注射缩宫素30 min内,模型组扭体次数增多(P<0.01),提示造模成功。与模型组比较,穴位埋线组、西药组扭体次数减少(P<0.01,P<0.05)。各组扭体次数结果同文献[9]。

2.2各组大鼠子宫组织中PGF2α含量的比较

与正常组比较,模型组大鼠子宫组织中PGF2α含量明显升高(P<0.05)。与模型组比较,穴位埋线组和西药组大鼠子宫组织中PGF2α含量明显降低(P<0.05)。穴位埋线组和西药组子宫组织中PGF2α含量差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1各组大鼠子宫组织中PGF2α含量的比较

2.3各组大鼠子宫组织中COX-2蛋白表达的比较

与正常组比较,模型组大鼠子宫组织中COX-2蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。与模型组比较,穴位埋线组和西药组子宫组织中COX-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。穴位埋线组和西药组子宫组织中COX-2蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2各组大鼠子宫组织中COX-2蛋白表达的比较

2.4各组大鼠子宫组织中phospho-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白表达的比较

与正常组比较,模型组大鼠子宫组织中phospho-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较,穴位埋线组子宫组织中phospho-NF-κB p65蛋白表达水平显著降低(P<0.05),而NF-κB p65蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),西药组子宫组织中phospho-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。与西药组比较,穴位埋线组子宫组织中phospho-NF-κB p65蛋白表达水平显著降低(P<0.05),而NF-κB p65蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3各组大鼠子宫组织中phospho-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白表达的比较

3、讨论

目前,临床治疗PD以口服非甾体类抗炎药或避孕药为主要治疗方法,但有报道[12,13]12-13]认为,此类药物若长期使用对肾脏及肝脏会有较大损害。研究[14,15]14-15]表明,穴位埋线治疗PD具有较好的近远期疗效,具有止痛快、疗效好、无不良反应的优点。前期研究[9]9]显示,穴位埋线和布洛芬均能减轻PD大鼠的扭体反应,改善病理损伤,且穴位埋线减轻PD大鼠扭体反应的效果优于布洛芬,这表明穴位埋线对治疗大鼠PD有肯定的效果。

目前认为PG是原发性痛经发病的关键因素,而非妊娠子宫内膜合成的PG中,PGF2α可引起子宫肌收缩引发疼痛[16]16]。已有临床研究[17]17]揭示,在PD患者血清中存在PG含量改变,痛经患者经血中的PGF2α浓度较正常妇女明显升高,既往研究[8,18]8,18]揭示穴位埋线可通过降低PGF2α的水平,缓解PD的疼痛反应。本研究结果显示模型组子宫组织中PGF2α含量明显升高,穴位埋线组和西药组子宫组织中PGF2α含量明显降低,提示穴位埋线可调控PD大鼠子宫组织中PGF2α的合成与释放。

COX-2为前列腺素合成过程中的限速酶。已有研究[19,20]19-20]表明,布洛芬等非甾体类抗炎药物可以抑制COX-2的活化,降低PG的水平,在PD中发挥有效的治疗作用。本研究结果显示,模型组COX-2蛋白表达较正常组明显升高,而穴位埋线组子宫组织中COX-2蛋白表达显著降低,表明穴位埋线可抑制PD大鼠子宫组织中COX-2蛋白表达。

NF-κB是一种重要的转录调节因子,能够调控COX-2的表达和活性[5]5],并且在PD中存在NF-κB的活化[9]9]。本研究结果显示,PD模型大鼠子宫组织中phospho-NF-κB p65蛋白和NF-κB p65蛋白表达明显升高,表明PD中NF-κB的磷酸化水平升高, NF-κB被活化;穴位埋线干预后phospho-NF-κB p65蛋白水平降低,而西药组大鼠子宫组织中phospho-NF-κB p65蛋白水平无明显变化,这提示穴位埋线可通过抑制NF-κB的磷酸化抑制NF-κB活化。已有研究[18]18]揭示穴位埋线可调控PD中PGF2α的水平,但调控机制未有报道。本研究揭示了穴位埋线对PD大鼠子宫组织NF-κB和COX-2的调控作用,提示穴位埋线可能通过调控NF-κB和COX-2来调控PGF2α的合成和分泌。

综上所述,穴位埋线“三阴交”和“关元”治疗PD的机制可能与抑制NF-κB活化,降低COX-2蛋白水平,从而有效调节PGF2α水平有关。

参考文献：

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唐文静,王乙钦,唐标.穴位埋线对原发性痛经大鼠子宫组织前列腺素相关因子和核转录因子κB的影响[J].针刺研究,2020,45(07):548-551+556.

基金:国家自然科学基金项目(No.81503385); 2018年湖南省大学生创新创业训练计划项目(No.433); 2018年度湖南中医药大学中西医结合一流学科开放基金项目(No.2018ZXYJH35);湖南中医药大学“十三五”一级学科基础医学建设项目(No.06)