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载氢-纳米氧化铈微泡对小鼠辐射损伤的防护作用研究

2020-07-23 269 上传者：管理员

摘要：为探讨载氢-纳米氧化铈微泡对小鼠辐射损伤的防护作用。本研究检测载氢-纳米氧化铈微泡的表征，并将60只BALB/c小鼠随机分为正常对照组、照射对照组、载氢-纳米氧化铈微泡组。小鼠经6Gyx射线一次性全身照射(剂量率2Gy/min)。于照射后3d和8d处死小鼠，检测其外周血细胞数、脾脏和胸腺指数、骨髓和脾脏组织病理学变化。结果显示，照射后3d和8d，与正常对照组相比，载氢-纳米氧化铈微泡组和照射对照组的白细胞均明显下降，相比照射对照组，载氢-纳米氧化铈微泡组有改善(p<0.05或p<0.01)；而载氢-纳米氧化铈微泡组和照射对照组的红细胞数和血红蛋白均略有下降，但差异无统计学意义。与正常对照组相比，微泡组的胸腺指数、脾脏指数均有下降，和照射对照组相比，载氢-纳米氧化铈微泡组的胸腺指数明显改善(p<0.05或p<0.01)。照射后3d，与正常对照组相比，照射对照组的骨髓细胞较少，存在细胞碎片，载氢-纳米氧化铈微泡组骨髓细胞数量略有减少，存在细胞核松散现象。而照射后8d，与正常对照组相比，照射对照组的骨髓细胞几乎找不到，载氢-纳米氧化铈微泡组骨髓细胞有一定数量，存在细胞凋亡现象。本研究表明，载氢-纳米氧化铈微泡通过保护造血组织、改善造血功能，对机体起到一定的辐射防护作用。

关键词：
载氢-纳米氧化铈微泡
辐射
造血功能
造血组织
防护作用
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随着核技术的广泛应用，机体遭受放射性损伤的风险大大增加(石童等,2014)。临床缺乏一种安全、有效、稳定和低毒的抗辐射药(孙兰兰等,2018)。因此研发一种新型的抗辐射损伤药物具有较大的应用前景。近年来研究表明，氢气和纳米氧化铈均具有抗辐射作用，氢气以富氢液的形式可通过清除机体的活性氧，从而起到抗辐射作用(Sanhuetal.,2014)。纳米氧化铈以悬浮液的形式灌入腹腔，通过保护造血组织，从而达到抗辐射目的(王春燕等,2016)。但富氢液制备条件苛刻，不易储存，因此应用价值不高。纳米氧化铈溶液在胸骨、十二指肠、大脑、胸腺和肺脏中可能有所蓄积，其本身具有低毒性，因此氧化铈须以微量进入体内，以保证其安全性(李宁等,2017)。

超声微泡是已被证实是一种理想载体，能包裹气体，吸附脂溶性物质，具有巨大的医学应用潜力(韦紫君等,2016)。而目前有关超声微泡抗辐射功能的研究并不多。本研究制备了一种安全、稳定的载氢-纳米氧化铈微泡，欲探讨其对小鼠抗辐射功能的影响。载氢-纳米氧化铈微泡既可提高氢气的应用价值，又能减少原本所需纳米氧化铈的剂量，降低了药物对机体的毒性作用。

1、结果与分析

1.1载氢-纳米氧化铈微泡的表征

显微镜下观察微泡的形态规则，发现其呈球形、中心透亮、分散性良好、无聚集(图1)。用Malvern激光粒径测量仪检测平均粒径，测得载氢-纳米氧化铈微泡平均粒径为(399.1±0.03)nm(图2)。

1.2照射后小鼠外周血计数的变化

照射后3d，与正常对照组相比，载氢-纳米氧化铈微泡组和照射对照组的白细胞明显下降，载氢-纳米氧化铈微泡组相比照射对照组有改善(p<0.05或p<0.01)，载氢-纳米氧化铈微泡组和照射对照组的红细胞、血小板和血红蛋白略有下降，但差异无统计学意义(图3A)。照射后8d，与正常对照组相比，载氢-纳米氧化铈微泡组和照射对照组的白细胞数、血小板数明显下降，载氢-纳米氧化铈微泡组相比照射对照组有明显改善(p<0.05或p<0.01)，载氢-纳米氧化铈微泡组和照射对照组的红细胞数和血红蛋白略有下降，但差异无统计学意义(图3B)。

1.3照射后脾脏和胸腺指数的变化

与正常对照组相比，载氢-纳米氧化铈微泡组的胸腺指数、脾脏指数略有下降；和照射对照组相比，载氢-纳米氧化铈微泡组的胸腺指数明显改善(p<0.05或p<0.01)，脾脏指数改善不明显，差异无统计学意义(图3A)。照射后8d，与正常对照组相比，载氢-纳米氧化铈微泡组的胸腺指数、脾脏指数下降明显，和照射对照组相比，载氢-纳米氧化铈微泡组的胸腺指数明显改善(p<0.05或p<0.01)，脾脏指数也有一定改善(图3B)。

图1载氢-纳米氧化铈微泡原图(A)及光镜图(B)

图2载氢-纳米氧化铈微泡的平均粒径及分散度

1.4照射后小鼠脾脏组织病理学变化

受照后3d，与正常对照组相比，载氢-纳米氧化铈微泡组和照射对照组的小鼠脾脏发生一定程度改变，表现为白、红髓结构总体不清，载氢-纳米氧化铈微泡组部分脾小结清楚，照射对照组欠清，脾血窦充血、扩张(图4A;图4B;图4C)。受照后8d，与正常对照组相比，照射对照组的小鼠脾脏发生明显改变，表现为淋巴细胞坏死、耗竭、网状细胞增生和巨核细胞缺失。而这种变化在载氢-纳米氧化铈微泡组明显减轻(图4D;图4E;图4F)。

1.5照射后小鼠骨髓组织病理学变化

受照后3d，与正常对照组相比，照射对照组的骨髓细胞较少，存在细胞碎片，载氢-纳米氧化铈微泡组骨髓细胞数量明显较多，有少数存在细胞核松散分散现象(图5A;图5B;图5C)。受照后8d，与正常对照组相比，照射对照组的骨髓细胞几乎找不到，载氢-纳米氧化铈微泡组骨髓细胞有一定数量，存在细胞凋亡现象(图5D;图5E;图5F)。

图3照射后小鼠外周血计数的变化及脾脏和胸腺指数

2、讨论

电离辐射主要损伤造血系统(周美娟等,2004)，因此造血系统是放射性损伤的高度敏感指标，照射后机体造血功能下降，造血干细胞急剧减少，使外周血细胞降低。因此改善血细胞计数是衡量抗辐射效果的生化指标之一。本实验中，受到照射后药物组相比正常对照组的外周血象发生不同程度的下降，尤以WBC发生最早且最明显，Plt、Hb和RBC缓慢下降，但相比照射对照组有所改善。表明载氢-纳米氧化铈微泡对造血功能有一定的恢复作用。脾脏、胸腺组织既是免疫器官，又具有造血功能，受照后胸腺、脾脏组织受损，体积缩小和体重下降。因此脾脏指数、胸腺指数是也是评价抗辐射效果的敏感指标之一。小鼠经6Gyx射线照射后，照射对照组的脾指数和胸腺指数明显下降，辐射后小鼠造血系统的功能受到严重影响，而载氢-纳米氧化铈微泡组能提高脾指数和胸腺指数，说明载氢-纳米氧化铈微泡对胸腺、脾脏有一定的保护作用。除脾脏外，骨髓也具有造血功能，因此辐射后脾脏、骨髓出现的一系列病理变化也成为评价抗辐射效果的重要指标之一。照射对照组小鼠脾脏细胞、骨髓细胞受损最严重，载氢-纳米氧化铈微泡组对脾脏、骨髓起到一定的防护作用。因此，载氢-纳米氧化铈微泡对放射性损伤的小鼠造血系统及造血功能具有一定的防护作用。

图4照射后小鼠脾脏组织病理学变化

图5照射后小鼠骨髓组织病理学变化

3、材料与方法

3.1材料

实验所用试剂及仪器有钛酸酯修饰的纳米氧化铈(纯度99.99%,粒径20nm,博培生物有限公司)，二棕榈酰磷脂酰胆碱、甲氧基-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(DPPC,mPEG-DPPE,Avanti);0.5%羧甲基纤维素纳溶液将1mg纳米氧化铈粉末配制成混悬液；全氟丙烷和氢气按1∶1的混合气体C3F8/H2(C3F8:天津核工业理化工程研究所;H2:重庆嘉庆气体有限公司)；甘油(Glycerol)、磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffersolution,PBS,pH=7.4);YJT-2银汞胶囊调合器(上海医疗器械股份有限公司)；CKX-41倒置荧光显微镜(Olympus);Malvern激光粒径检测仪(重庆大学实验室)。

3.2载氢-纳米氧化铈微泡的制备

由磷脂成膜材料吸附修饰后的纳米氧化铈，并包裹混合气体C3F8/H2形成，制备方法为机械振荡法。将5mgDPPC、2mgmPEG-DPPE、1mg钛酸酯修饰的纳米氧化铈混合于一管型瓶中，加入450μLPBS溶液和50μL甘油，密封后，50℃水浴30min，冷却至室温后，注入混合气体C3F8/H2。银汞胶囊调合器水平振荡50s，频率>4000r/min；存于4℃冰箱备用。

3.3载氢-纳米氧化铈微泡的表征分析

微泡经稀释、离心后，用正置显微镜观察其形态、大小及分布；Malvern激光粒径测量仪检测平均粒径。

3.4实验动物及分组

SPF级Balb/c小鼠，雌雄各半，18～20g。小鼠适应性喂养7d后随机分为3组：A组(实验组为载氢-纳米氧化铈微泡)；B组(照射对照组)予以生理盐水处理；C组(正常对照组)，予以生理盐水处理。均以2mL/g腹腔注射，每日1次，连续14d。每组20只小鼠，雌雄各半。

3.5照射条件

照射时，将小鼠装入小鼠固定器固定，每10只一批次进行照射，皮源距1m，辐射总剂量：6Gyx射线，2Gy/min，累积时间3min。

3.6样本检测

照射后第3天、第8天随机取每组中的10只小鼠，称取小鼠体质量后，从小鼠眼眶取血后，颈椎脱臼处死。

3.6.1外周血细胞分析

眼眶取EDTA2Na抗凝血后，对白细胞、红细胞、血小板、血红蛋白进行计数。

3.6.2脾脏和胸腺指数

处死小鼠后取脾脏和胸腺称重，计算脏器指数。以小鼠胸腺、脾脏的重量除以小鼠体重，得到胸腺指数和脾脏指数(脾脏重量(mg)/体重(g)×10;胸腺重量(mg)/体重(g)×10)。