首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 医学毕业论文 > 医学本科毕业论文 > 基于转录组测序的EV71感染RD细胞细胞自噬和免疫的影响及其作用机制

基于转录组测序的EV71感染RD细胞细胞自噬和免疫的影响及其作用机制

2020-08-20 502 上传者：管理员

摘要：目的：基于转录组测序技术探讨肠道病毒71型(EV71)感染对人横纹肌肉瘤(RD)细胞自噬和免疫的影响及其作用机制。方法：用不同剂量EV71感染RD细胞确定感染复数(MOI)。在MOI=1时选择不同时间点(0、0.5、1、1.5、3、6、9和12h)共8组进行后续实验。倒置显微镜观察细胞形态和数量变化；蛋白免疫印迹(Westernblot)检测蛋白表达情况；运用转录组测序技术分析细胞功能及基因表达的变化；高内涵细胞成像技术观察细胞内蛋白表达情况。结果：倒置显微镜可见细胞在病毒感染3h由梭形贴壁逐渐变为圆形悬浮，细胞数量相比0h明显减少(P<0.05)。Westernblot结果显示细胞在感染后6h、9h、12h，病毒在RD细胞内已经表达病毒衣壳蛋白1(VP-1)，感染后9h自噬相关蛋白LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ与0h组相比明显升高(P<0.01)。转录组测序结果显示EV71感染RD细胞后3h细胞内基因表达变化达到峰值，上调基因1199个，下调基因126个。KEGG分析提示改变的信号通路分子大多与自噬和免疫相关。高内涵细胞成像显示细胞在感染后数量减少，细胞内自噬蛋白平均荧光强度增加(P<0.05)。结论：EV71感染RD细胞通过自噬相关信号通路促进病毒在细胞内完成复制和组装。

关键词：
人
基因表达
肠道病毒A型
自噬
转录组
加入收藏

肠道病毒71型是一种单股正链小RNA病毒，5岁以下儿童感染后可以出现手足口病[1]。该病症状主要有发热、手足口疱疹，少数患儿会出现中枢神经系统症状，如脑膜炎、脑炎、急性弛缓性肌无力、脊髓灰质炎、肺水肿等临床表现，甚至出现死亡[2]。HFMD通常在每年夏季发生，且近些年冬春季发病率也明显上升，2008年被列为国家法定传染病[3]。目前国内外学者从细胞凋亡[4]、自噬[5]、焦亡[6]等方面对EV71诱发HFMD的分子机制进行了研究，但确切致病机制尚不明确。本课题组前期研究已经证实EV71可以引起人横纹肌肉瘤细胞和人胃黏膜上皮细胞系GES-1发生自噬和凋亡[5,7]，但是这些变化的发生时间及影响因素尚缺乏明显的证据。本实验拟探究EV71感染细胞后自噬和免疫应答相关基因表达发生改变的时间和具体靶点，以期为HFMD的治疗提供新的思路。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株和病毒株

RD细胞株购于中国科学院细胞库，EV71型病毒株由北京协和医学院病原生物学研究所赵振东教授课题组惠赠。

1.1.2试剂及仪器

DMEM高糖培养基、胰酶、胎牛血清、二喹啉甲酸（BCA）试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，兔源一抗微管相关蛋白1轻链3(LC-3）、自噬相关基因5(Atg5）、病毒衣壳蛋白1(VP-1）购自CST公司，鼠源一抗雷帕霉素不敏感的mTOR伴侣蛋白（Rictor）购自GeneTex公司，兔源一抗β-actin购自沈阳万类生物科技有限公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠和山羊抗兔二抗、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAG）配制试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，总RNA提取试剂（TRIzol）购自Invitrogen公司，其他试剂均选自国内公司的分析纯。3111型CO2恒温培养箱购自美国ThermoFisher公司，Eon微孔板酶标仪购自美国BioTek公司，DMI3000B倒置荧光显微镜购自德国Leica公司，垂直电泳仪、电转仪、UniversalHoodⅢ凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养

RD细胞培养于DMEM高糖培养基（含10%胎牛血清，100mg/L链霉素和100U/mL青霉素）中，37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中，每2d细胞换液1次，长满培养皿后传代。

1.2.2病毒扩增

RD细胞培养至汇合度约90%，提前1h换液，-80℃冰箱取出EV71病毒液，按1︰5加入细胞培养液中，十字混匀，37℃、5%CO2培养箱培养24h。倒置显微镜下观察染毒细胞全部死亡后，收集上清于15mL离心管，4℃、4000r/min离心10min，上清分装标记并冻存于-80℃冰箱。

1.2.3病毒滴度测定

取生长状态良好的RD细胞，计数，接种至96孔板，每孔100μL，含5000个细胞。按10倍倍比稀释病毒，每个浓度加1列，共11列，第12列加等量培养基作阴性对照。培养48h后标记50%以上细胞致死的孔，按公式计算半数组织培养感染剂量（50%tissuecultureinfectivedose,TCID50），按照卡波公式计算并换算感染复数（multiplicityofinfection,MOI）。

1.2.4不同时间和剂量病毒对细胞的作用

RD细胞接种至6孔板，按MOI=10、MOI=1、MOI=0.1给各孔加病毒液，培养12h后收集细胞，提取总蛋白。通过蛋白免疫印迹（Westernblot）技术观察VP-1的表达量，并分析筛选合适的MOI。根据筛选结果以MOI=1感染细胞，选择0、0.5、1、1.5、3、6、9、12h共8组，倒置显微镜观察细胞形态和数量变化。

1.2.5Westernblot检测蛋白表达

收集各组细胞，加入含苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonylfluoride,PMSF）的蛋白裂解液，冰上裂解30min,12000r/min离心15min,BCA试剂盒测总蛋白质浓度。SDS-PAGE分离蛋白约2h，转硝酸纤维素（NC）膜1h,5%脱脂奶粉封闭2h，一抗孵育4℃过夜。次日清洗3次，用HRP标记的二抗孵育2h，加底物显色，凝胶成像系统扫描并分析结果。

1.2.6总mRNA提取及测序

同1.2.4处理并收集细胞，分别加TRIzol，吹打均匀，经干冰运输至华大基因公司武汉公司进行转录组测序。提取出的RNA经检测合格后，反转录成cDNA。末端连接接头，进行PCR扩增，产物热变性成单链，建立单链环状DNA文库，CG测序仪测序。

1.2.7高内涵细胞成像检测相关蛋白表达

提前1d细胞换液并计数，将RD细胞接种至96孔板，每组设3个复孔，按照MOI=1选择不同时间进行干预。干预后吸净培养基，4%多聚甲醛固定30min，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后用0.5%Triton-X100室温通透20min，山羊血清封闭30min。根据测序结果各孔按1︰5000浓度比加适量Atg5、Rictor抗体，4℃过夜。次日PBS清洗后加荧光二抗，室温避光孵育1h,4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染细胞核10min,PBS清洗后上机检测。

1.3统计学方法

测序数据运用GO、KEGG等软件进行分析，其他数据采用SPSS22.0软件进行分析。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1EV71感染对RD细胞形态和功能变化的影响

倒置显微镜明场观察可见，培养中的RD细胞在接触EV71后0.5h即可出现明显的空斑，3h细胞由梭形贴壁生长逐渐变为圆形悬浮，与0h组相比细胞数量明显减少（F=193.330,P<0.05）。9h圆形细胞约占总数的50%,12h约占70%，提示病毒已经开始大量繁殖和释放，细胞死亡；而正常培养细胞生长状态良好，仍然维持梭形贴壁生长。见图1。

2.2不同剂量和时间EV71感染RD细胞对蛋白表达的影响

图1不同时间EV71感染RD细胞形态和数量变化

EV71感染RD细胞12h后，病毒已经在细胞内有所复制，VP-1表达量随MOI增加而升高（F=7.133,P<0.05），见图2A、B。MOI=1时已经可以看到明显的VP-1条带，因此后续实验全部选择MOI=1进行细胞感染。在MOI=1时病毒感染后6h、9h、12h，病毒在RD细胞内已经开始表达VP-1，细胞内已经合成新的病毒，但3个时点间VP-1的表达量差异无统计学意义（F=0.201,P>0.05），见图2C、D；而细胞自噬相关蛋白LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ的变化出现在感染后9h，高于0h组（F=12.005,P<0.01），见图2E、F。

2.3EV71感染RD细胞对基因表达的影响

转录组测序结果显示，EV71感染RD细胞后0.5h，细胞内上调基因294个，下调基因34个（图3A），感染后1h上调基因29个，下调基因52个（图3B),1.5h上调基因707个，下调基因72个（图3C）。基因表达变化峰值出现在感染后3h（图3D），上调基因1199个，下调基因126个。在感染后6h、9h、12h基因表达变化略有下降，分别上调基因403、747、758个，下调基因472、184、169个（图3E～G）。感染病毒0.5h后已经有病毒侵入细胞，而3h病毒已经开始通过影响细胞基因表达而启动病毒复制。

图2不同剂量和时间EV71对RD细胞蛋白表达的影响

2.4EV71感染RD细胞对信号通路分子的影响

通过GO富集和KEGG信号通路分析发现，在EV71感染RD细胞3h，细胞信号通路基因有216个发生变化（绿色），其中100多个信号分子均参与细胞的自噬或凋亡。在组织系统相关基因中，内分泌系统、免疫系统和神经系统基因表达上调也比较明显（黄色），这与临床上常见的症状相吻合。见图4。

2.5EV71感染RD细胞对自噬蛋白的影响

高内涵细胞成像结果显示，RD细胞在感染后细胞数量明显减少，病毒感染引起细胞产生病变和死亡。但细胞内平均荧光强度明显增加，随着病毒进入细胞，引起细胞内自噬蛋白Atg5(F=3.719,P<0.05）、Rictor(F=3.588,P<0.05）表达上调，见图5。

图3病毒干预不同时间点的基因表达变化

图4GO富集和KEGG信号通路分析EV71感染RD细胞3h后基因差异表达

3、讨论

3.1EV71感染RD细胞6h即出现病毒复制

结果显示，RD细胞在感染EV71后0.5h即可见细胞状态变差，空斑形成增多；3h细胞数量明显下降，说明此时病毒开始在细胞内完成RNA复制，蛋白质合成、包装和释放。Westernblot结果显示，细胞在病毒感染后6h才能翻译出结构蛋白VP-1。病毒感染细胞后病毒RNA释放进入被感染细胞、RNA复制负链互补RNA、翻译多聚蛋白质、剪切成4个结构蛋白（VP1～4）和7个非结构蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)[8,9]，包装病毒颗粒并释放。在此过程中，宿主细胞可以通过抑制自噬来增强病毒的复制[3]，但是也可能是通过增强自噬实现对宿主细胞的免疫逃逸[5]。

图5高内涵成像显示病毒感染后蛋白表达情况

3.2EV71感染RD细胞3h出现信号通路分子变化

转录组测序结果显示，病毒感染后基因表达变化的峰值出现在3h，上调基因1199个，说明该时点是病毒复制和包装的关键点。上调的基因中信号转导相关216个，其中大多数与自噬和凋亡有关。Shi等[10]证明EV71通过引起宿主细胞发生凋亡进而引起病毒的释放。Yeganeh等[11]认为EV71通过增强宿主细胞的自噬而引起免疫逃逸。为了明确自噬信号通路与病毒复制的关系，本研究进一步分析转录组测序数据。

3.3EV71感染RD细胞通过自噬信号分子产生免疫应答

KEGG信号通路富集分析显示，在病毒感染后3h，与自噬相关的多个信号分子被激活，高内涵细胞成像结果也证实在感染后9h自噬蛋白Atg5和mTOR伴侣蛋白Rictor的表达上升。mTOR通路是经典的自噬信号通路，与细胞内代谢调控相关，主要受胰岛素的激活，对机体能量代谢有重要的调节作用[12]。抑制mTOR信号通路可以增强细胞自噬，是一种饥饿状态下细胞调节能量代谢的重要方式，病毒诱导的细胞自噬同时也可以引起mTOR通路的激活[13]。EV71在进入RD细胞后激活mTOR信号分子，增强细胞自噬，有助于细胞清除病毒，但病毒也可能通过激活细胞自噬产生对机体的免疫逃逸作用，有利于病毒在细胞内的复制与释放。

综上所述，EV71感染后3h激活宿主细胞自噬信号通路，6h病毒衣壳蛋白合成，开始组装新的病毒，12h宿主细胞自噬达峰值，新病毒释放。这种病毒感染过程与细胞自噬有可能是病毒免疫逃逸的一种机制，笔者会持续关注EV71感染后细胞自噬分子时间和空间的变化，以期发现EV71感染细胞后引起免疫应答的确切机制。

参考文献：

[2]谢广成,段招军.EV71的感染和抗病毒天然免疫应答[J].病毒学报,2016,32(4):501-508.

[12]李帅,方磊,王炯,等.金黄色葡萄球菌通过TLR2/PI3K信号诱导巨噬细胞的炎症反应和自噬[J].细胞与分子免疫学杂志,2017,33(9):1160-1164.

程凯,曹丽,张鑫艳,郝晋芳,张晓延.基于转录组测序的EV71感染RD细胞的基因表达变化研究[J].天津医药,2020,48(08):689-694.