脱氧核糖核酸（DNA）作为遗传信息和基因表达的载体，不仅控制着生物体的生长发育、繁殖等正常的生命活动，而且在一些疾病的发生如癌变的过程中起重要作用，因此DNA也是很多药物在体内发挥作用的重要靶标[1,2,3,4]。基于此，研究药物分子与DNA的相互作用可追根溯源从分子水平深层次地研究药物的作用机制，有助于体外筛选药物、开发新药尤其是抗肿瘤药物等研究的顺利进行。据报道，DNA与靶向药物分子的结合方式大多为非共价结合，可分为静电作用、沟槽结合、嵌插结合3种方式[1,5]。非甾体抗炎药是仅次于抗感染药的临床第二类常用药[6]，除了解热镇痛作用外，近年来临床研究发现其在预防胃癌、阿尔兹海默症的防治中发挥重要作用[7,8]。替诺昔康为苯噻嗪酰胺类非甾体抗炎药，能选择性抑制环氧酶-2，具有良好的耐受性，因此临床治疗中普遍应用[9,10]。本研究通过光谱法、热力学理论等方法研究小牛胸腺DNA(ctDNA）与替诺昔康的相互作用，为阐述药物的治病机制、作用方式提供支持，而且对于药物筛选、新药开发及推进靶向药物的研究与开发具有十分重要的意义。

1、材料

UV-2550型紫外–可见分光光度计（日本岛津公司）；F-7000型荧光光谱仪（日本日立公司）；AL204型分析天平（上海梅特勒–托利多仪器有限公司）；乌氏黏度计（上海垒固仪器有限公司）；DK-S22型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）。

ctDNA（北京奥博星生物技术责任有限公司），经UV光谱检验A260nm/A280nm>1.8，纯度符合要求；盐酸小檗碱（批号M060714，常州亚邦制药有限公司）；替诺昔康（质量分数≥98%，批号110102，三洹医药化工有限公司）；其他试剂均为分析纯，实验用水为重蒸水。

2、方法与结果

2.1溶液的配制

2.1.1替诺昔康储备液的制备

精密称取21mg替诺昔康，溶于2mL无水乙醇，用NaCl-Tris-HCl缓冲溶液定容至25mL，得替诺昔康储备液I。量取0.1mL储备液I，用NaCl-Tris-HCl缓冲溶液稀释到10mL，即为2.5×10-5mol/L替诺昔康储备液。

2.1.2ctDNA储备液的制备

精密称取23mgctDNA，加NaCl-Tris-HCl缓冲溶液溶解，定容于10mL量瓶中，即ctDNA储备液（浓度为2.5×10-2mol/L），放置于冰箱中，0～4℃储存备用。

2.1.3盐酸小檗碱溶液的配制

精密称取50.9mg盐酸小檗碱，用少量无水乙醇溶解，NaCl-Tris-HCl缓冲溶液定容至25mL，即得。

2.1.4ctDNA-盐酸小檗碱溶液的制备

精密称取ctDNA9.28mg，用NaCl-Tris-HCl缓冲溶液溶解，向其中加入1.4mL，浓度为5.0×10-3mol/L盐酸小檗碱溶液，用NaCl-Tris-HCl缓冲液定容至100mL，使盐酸小檗碱质量浓度为7.0×10-5mol/L。

2.2替诺昔康与ctDNA相互作用的紫外光谱

向比色皿中加入2.5mL替诺昔康储备液（2.5×10-5mol/L），用微量注射器逐次滴入2.5×10-2mol/LctDNA储备液10μL，使体系中ctDNA浓度分别为0.0、1.0×10-4、2.0×10-4、3.0×10-4、4.0×10-4、5.0×10-4mol/L，以对应浓度的ctDNA溶液为参比。溶液混匀静置5min后，在200～600nm测定替诺昔康的紫外吸收光谱。结果见图1。可见ctDNA的加入使替诺昔康的吸光度降低，即出现减色效应，说明替诺昔康与ctDNA之间发生相互作用，形成了二元复合物。据报道，DNA与药物分子以嵌插方式和沟槽作用结合时，紫外光谱会发生变化，若出现减色效应（≥35%）并且伴随红移现象（≥10nm），说明药物分子与DNA以嵌插方式结合，否则为沟槽作用[1,11,12]。ctDNA与替诺昔康相互作用的紫外光谱中虽有减色效应出现，但是其减色强度较弱，明显<35%，因此推断替诺昔康与ctDNA可能以沟槽作用相结合。

图1ctDNA浓度对替诺昔康紫外光谱的影响

2.3替诺昔康与ctDNA相互作用的荧光猝灭机制

向荧光样品池中加入1.0×10-4mol/LctDNA-盐酸小檗碱溶液2.5mL，然后向其中逐次加入5mL替诺昔康储备液（2.5×10-3mol/L），使体系中替诺昔康浓度分别对应为0.0、0.5×10-5、1.0×10-5、1.5×10-5、2.0×10-5、2.5×10-5、3.0×10-5、3.5×10-5mol/L。溶液混匀静置5min后，设定激发波长为365nm，激发/发射狭缝宽为5nm，扫描250～700nm的荧光发射光谱，20℃下测定ctDNA-盐酸小檗碱–替诺昔康体系的荧光发射光谱。

由文献可知，盐酸小檗碱自身荧光极弱，当以嵌插方式与结合后，其荧光强度显著增强，因此盐酸小檗碱常被作为荧光探针用于药物与相互作用的研究。本课题组前期工作发现[11]，当盐酸小檗碱浓度为7.0×10-5mol/L时ctDNA-盐酸小檗碱体系荧光强度最大，因此后续试验均在该浓度下开展。研究发现替诺昔康本身不发射荧光，与ctDNA溶液混合后亦不发射荧光，因此借助盐酸小檗碱为荧光探针，考察替诺昔康与的相互作用情况。

不同浓度的替诺昔康存在时，ctDNA-盐酸小檗碱-替诺昔康体系的荧光发射光谱见图2。可见，随着替诺昔康浓度的增加，ctDNA-盐酸小檗碱体系的荧光逐渐被猝灭，说明替诺昔康与ctDNA-盐酸小檗碱发生了相互作用。

一般引起ctDNA-盐酸小檗碱发生荧光猝灭现象，原因可能有以下几种[11]:(1）替诺昔康与盐酸小檗碱竞争结合ctDNA上的位点，替诺昔康的加入量越多，原本结合在ctDNA上的盐酸小檗碱被替诺昔康置换出来的就越多，使ctDNA-盐酸小檗碱体系的荧光强度降低。（2）替诺昔康、ctDNA竞争结合盐酸小檗碱，导致原本与ctDNA结合的盐酸小檗碱浓度下降，促使ctDNA-盐酸小檗碱发生荧光猝灭。（3）替诺昔康与ctDNA-盐酸小檗碱体系形成新的无荧光现象的复合物即ctDNA-盐酸小檗碱-替诺昔康，导致体系荧光强度下降。然而，紫外光谱已经证明替诺昔康与ctDNA的结合不是嵌插方式，因此替诺昔康与盐酸小檗碱不存在竞争；此外，随着替诺昔康的加入盐酸小檗碱的荧光光谱没有发生明显的变化，表明替诺昔康与盐酸小檗碱之间不存在相互作用，由此基本排除了原因（1）、（2），即替诺昔康与ctDNA-盐酸小檗碱间发生相互作用，且形成无荧光的复合物。

图2替诺昔康对ctDNA-盐酸小檗碱荧光猝灭光谱图

为进一步研究替诺昔康与ctDNA-盐酸小檗碱间相互作用机制，对荧光数据进行计算。一般来说荧光猝灭可分为静态猝灭和动态猝灭，若替诺昔康对ctDNA-盐酸小檗碱的荧光猝灭属于动态猝灭，则其作用过程应遵循Stern-Volmer方程[13]，其中F0、F表示有、无替诺昔康存在时ctDNA-盐酸小檗碱溶液的荧光强度，KSV是Stern-Volmer猝灭常数，[Q]为替诺昔康浓度，Kq是由扩散控制的双分子动态猝灭速率常数，τ0是生物大分子内源性荧光寿命，约为1×10-8s。

（公式）

根据公式（1）以F0/F对[Q]作图，得到回归方程Y=0.4701X+1(R2=0.9826）。该直线的斜率即为动态猝灭常数，得替诺昔康的KSV=4.7×104L/mol，由式（2）得Kq=4.7×1012L/mol·s。一般认为，各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数为2.0×1010L/mol·s[13]，替诺昔康对ctDNA动态猝灭速率常数大于此值，故猝灭过程不是由动态碰撞引起的，而是属于静态猝灭。

对于形成复合物的静态猝灭，可以根据Lineweaver-Burk双倒数方程[11]求算出结合常数：

（公式）

式中，F0和F代表有无替诺昔康时ctDNA-盐酸小檗碱体系在527nm处的荧光强度，[Q]代表替诺昔康的浓度，KLB代表结合常数。以(F0-F)-1对F0[Q]-1作图，得回归方程Y=1.3168X+1.3614(R2=0.9838）。根据直线斜率可得结合常数KLB=1.03×105L/mol。

2.4替诺昔康与ctDNA相互作用的结合方式

2.4.1单双链DNA研究

将双链DNA(dsDNA）在100℃的水浴锅中加热30min，然后放置于冰水浴中快速冷却10min，即可得变性单链DNA(ssDNA）。依照2.3项下操作，用荧光光谱仪考察ssDNA与替诺昔康的相互作用情况。按LineweaverBurk双倒数方程计算得到的结合常数KLB=3.89×104L/mol，而dsDNA-盐酸小檗碱与替诺昔康相互作用结合常数KLB=1.03×105L/mol。显然，替诺昔康与ssDNA的结合作用要弱于替诺昔康与dsDNA，对此现象的解释则归结为替诺昔康与ctDNA主要以沟槽作用结合。由于沟槽作用是指小分子药物与ctDNA大沟或小沟的碱基对边缘直接结合[1]，而dsDNA解链后沟槽结构遭到破坏，虽然ssDNA在溶液中以线团形状存在，在线团表面形成的许多凹点可与小分子发生氢键作用，因此替诺昔康对ssDNA-盐酸小檗碱的荧光仍存在猝灭，但是与dsDNA相比替诺昔康与ssDNA-盐酸小檗碱结合的几率还是小得多。

2.4.2DNA热熔链实验

在250mL量瓶中加入1×10-2mol/LctDNA溶液1.25mL和2.5×10-3mol/L替诺昔康溶液1mL，用Tris-HCl-NaCl缓冲液稀释、定容，转移至100mL锥形瓶中，固定于恒温水浴槽中。调节水浴锅温度20～100℃，间隔2～5℃取样品，在260nm波长下测得吸光度值。常温下，DNA双螺旋结构是较稳定的结构，但是当将其加热到一定温度时，其双螺旋结构会发生裂解，使其紫外光谱中260nm处的吸光度值增加，即发生增色效应。DNA解旋一半时达到的温度称为DNA的热变性温度（Tm），当小分子药物与DNA相互作用时，其结构受到影响也会使Tm值产生变化。若小分子与DNA以嵌插方式结合时，Tm升高5～8℃，小分子与DNA以沟槽或静电方式结合时，Tm变化不大[11]。因此，为了进一步确证替诺昔康与ctDNA以沟槽作用结合，利用紫外分光光度计考察替诺昔康对ctDNA的Tm影响，结果见图3。可见加入替诺昔康后，ctDNA的Tm没有显著的变化，表明替诺昔康与ctDNA的结合不是嵌插方式，而是沟槽结合。

图3替诺昔康对ctDNA热变性影响的曲线

2.4.3黏度实验

在（25.0±0.2）℃超级恒温槽中，向黏度计中加入1×10-5mol/LctDNA溶液20mL，逐次加入2.5×10-3mol/L替诺昔康储备液20μL，测量3次体系的流动时间计算平均值。加入替诺昔康后ctDNA的相对黏度按公式η=（t-to）/to计算，式中to、t分别为ctDNA溶液及不同替诺昔康比例的ctDNA-替诺昔康溶液流经毛细管所需的时间，η0为无替诺昔康时ctDNA溶液的相对黏度，以(η/η0)1/3对[替诺昔康]/[ctDNA]作图，见图4。

图4不同替诺昔康浓度对ctDNA体系黏度的影响

一般来说，若DNA与小分子药物以静电作用或沟槽作用结合时，会使双螺旋结构出现扭转、弯曲，使DNA的相对黏度降低或保持不变；若DNA与药物分子以嵌插作用结合，插入的药物分子会使DNA相邻碱基对间的距离增大，从而伸长扭曲DNA双螺旋结构，导致相对黏度增大[14]。可以看出，替诺昔康的加入使得ctDNA溶液的黏度降低，表明替诺昔康与ctDNA的作用不是嵌插结合，而是沟槽结合。

3、讨论

本实验采用紫外光谱法和荧光光谱法考察了替诺昔康与ctDNA间相互作用，结果表明替诺昔康与ctDNA形成基态复合物，从而导致ctDNA-盐酸小檗碱荧光发生了静态猝灭作用。众所周知，DNA溶液的黏度与DNA长度密切相关，当DNA链增长时，溶液黏度增加；反之，则黏度下降，因此，黏度试验是用于判断小分子药物与DNA结合模式最重要手段之一。本研究发现，替诺昔康可降低ctDNA溶液的黏度，因此排除嵌插作用。进一步研究发现，替诺昔康并没有导致ctDNA的Tm发生显著的变化。而一般情况下，如果小分子药物以插入模式与DNA结合时，配体插入碱基对之间可发生稳定的π-π*堆积作用，进而可促使DNA的Tm显著升高，因此进一步证实替诺昔康与ctDNA间相互作用并非插入模式。此外，对比单、双链DNA与替诺昔康相互作用研究发现，替诺昔康与ssDNA间的结合作用明显小于替诺昔康与双链DNA间的结合作用，也从另一个角度证明二者间相互作用方式并非静电或插入模式。

综合实验结果，充分证实替诺昔康与ctDNA的作用方式为沟槽结合，即替诺昔康与ctDNA碱基对的边缘发生了相互作用。本实验对进一步开发替诺昔康、了解其抗炎机制，对DNA的损害及其毒副作用考察和全面评价非甾体类抗炎药的安全性能等方面研究提供科学依据有积极意义。

参考文献：

[1]李俊芬.喹啉､异喹啉类生物碱发光探针与相互作用的研究[D].太原:山西大学,2008.

[2]曹晓丽,郝俊旭,刘彬,等.光谱法研究盐酸二氧丙嗪与DNA的相互作用[J].药学研究,2018,37(2):75-77.

[3]许明玲,张晨,林泳佳,等.盐酸异丙嗪与DNA相互作用的光谱学研究[J].药学研究,2017,36(11):630-633.

[4]曹晓丽,王新,张麒,等.灿烂甲酚蓝与DNA结合模式的荧光光谱法研究[J].哈尔滨商业大学学报,2019(3):261-264.

[5]蔡健,贺玉婷,李红霞,等.2-(2-吡啶基)苯并噻唑的Mn(Ⅱ)､Zn(Ⅱ)､Co(Ⅱ)的金属配合物的合成以及与DNA相互作用的研究[J].生物化工,2019,5(4):46-50.

[6]李健和,胡焰,曹俊华,等.非甾体抗炎药物注射制剂的开发与临床应用[J].中国新药与临床杂志,2013,32(3):167-176.

[7]臧永红,张晶,李思远,等.非甾体抗炎药防治阿尔茨海默病的研究进展[J].实用医药杂志,2018,35(12):1134-1137.

[8]高宇飞,张腊红,方家恒,等.非甾体抗炎药在预防胃癌中的研究进展[J].健康研究,2019,39(4):432-434,438.

[9]彭梦侠,姚婉清,陈梓云.红外光谱法结合判别分析法对抗风湿类中成药中替诺昔康的快速筛查[J].理化检验:化学分册,2018,54(11):1241-1245.

[10]武钏,王茹林,陈静,等.β-环糊精衍生物对TNX的增溶作用[J].中国药物与临床,2010,10(1):68-69.

[11]王冬晶.金刚乙胺类希夫碱的合成及生物活性研究[D].沈阳:辽宁大学,2012.

[13]毛红艳,刘雪雪,张长征.靛玉红与DNA相互作用的荧光光谱研究[J].光散射学报,2018,30(1):84-88.

马喆.光谱法研究替诺昔康与小牛胸腺DNA相互作用[J].现代药物与临床,2020,35(08):1532-1536.