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诃子鞣酸对乌头碱致H9C2细胞损伤的保护作用及机制研究

2020-08-28 392 上传者：管理员

摘要：目的：通过研究诃子鞣酸对乌头碱致H9C2细胞损伤的保护作用,探讨蒙药诃子制草乌炮制减毒机制。方法：以不同浓度的乌头碱、诃子鞣酸及乌头碱+诃子鞣酸分别作用于H9C2细胞,利用高内涵分析(HCA)技术检测并分析药物对H9C2细胞数量、细胞核面积、细胞核DNA含量、Ca2+荧光强度及线粒体功能的影响。结果：10、20μmol/L乌头碱作用于H9C2细胞24h后,可导致细胞内Ca2+超载;20μmol/L乌头碱可致H9C2细胞线粒体功能障碍;5、10、20μmol/L诃子鞣酸单独作用于H9C2细胞均无明显毒性;当10、20μmol/L诃子鞣酸与20μmol/L乌头碱共同作用于H9C2细胞24h后,线粒体功能恢复,细胞内Ca2+荧光强度降低;与对照组相比,无明显差异。结论：乌头碱会引起H9C2细胞Ca2+超载和线粒体功能障碍,可能是草乌致心肌细胞毒性的主要原因。诃子中的诃子鞣酸可明显抑制由乌头碱引起的Ca2+超载,改善线粒体功能,起到解草乌毒的作用。

关键词：
H9C2细胞
乌头碱
炮制减毒
药学
诃子制草乌
诃子鞣酸
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草乌,为毛茛科植物北乌头AconitumkusnezoffiiReichb.的干燥块根,具有祛风除湿、温经止痛的作用。草乌生品有大毒,临床多炮制后使用[1]。草乌的毒性主要由其生品中含有的双酯型生物碱所致,主要靶器官为心脏,心律失常是其中毒的主要表现[2],因此常用心肌细胞(H9C2细胞)损伤模型研究乌头碱的毒性[3,4]。诃子,为使君子科植物诃子TerminaliachebulaRetz.或绒毛诃子TerminaliachebulaRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果实,具有抗菌、抗氧化、解毒、强心的作用。蒙医用草乌必用诃子,有“诃子可解乌头毒”的理论[5,6]。课题组前期研究发现,诃子制草乌可明显降低草乌的毒性,诃子制草乌对小鼠半数致死量(LD50)为1.1690g/kg,而生草乌为0.7009g/kg[7]。文献研究表明,诃子本身具有一定的心肌保护作用[8,9,10]。通过对诃子制草乌特征图谱分析可知,炮制品中除含有乌头碱等成分外,还含有诃子鞣酸等诃子中的化学成分[11]。为了进一步探讨诃子制草乌的减毒原理,本研究利用高内涵分析技术,研究诃子鞣酸对乌头碱致H9C2心肌细胞毒性的保护作用。

1、材料

1.1细胞株

大鼠H9C2心肌细胞,购自北京协和医学院细胞资源中心。

1.2主要试剂

乌头碱对照品(批号:110720-201111,纯度≥98%)购自中国食品药品检定研究院。诃子鞣酸(批号:Z06D5B2,纯度≥98%)购于上海源叶生物科技有限公司。二甲基亚砜(DMSO,批号:D5879-100ML)购自Sigma公司。多柔比星(Dox,批号:25316-40-9)购自中国食品药品检定研究院。

高糖DMEM基础培养基(批号:8118097)、胎牛血清(FBS,批号:758093)、胰酶-EDTA(批号:15400-054)、PBS缓冲液(批号:20012-068)、青霉素-链霉素(批号:30-002-CI),均购自Gibco公司。四甲基罗丹明甲酯(TMRM,批号:T668)、钙黄绿素(Calcein-AM,批号:65-0853-39)、Hoechst33258(批号:94406)均购自Invitrogen公司。其他试剂均为分析纯。

1.3主要仪器及设备

ImageXpressMicroXLS宽场高内涵成像分析系统(MolecularDevices公司),生物安全柜(美国Thermo公司),CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)。

2、方法

2.1药物制备

分别精密称取适量乌头碱、诃子鞣酸,用甲醇配成4mmol/L的储备液,临用时用培养基分别稀释到20、10、5μmol/L,终溶液中甲醇含量低于0.5%。以5、10μmol/L多柔比星为阳性药,DMSO溶解,然后用培养基稀释至所需浓度。

2.2细胞培养

H9C2细胞培养于含10%FBS、1%青霉素-1%链霉素的高糖DMEM完全培养基中。细胞置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养,待生长至70%～80%融合时,用0.25%胰酶-0.02%EDTA溶液消化传代。

2.3给药及指标检测

在96孔细胞培养板中每孔加入鼠尾I型胶原蛋白50μL,包被过夜后吸出剩余胶原蛋白,无菌纯水漂洗3次。收集对数生长期H9C2细胞,3000个/孔种板,150μL/孔。37℃、5%CO2培养箱中培养24h。弃去培养基,分别加入用完全培养基稀释的待测药物150μL/孔,对照组加入等量培养基,37℃避光,5%CO2培养24h。每孔加入5mg/L的Hoechst33258、TMRM、Calcein-AM的完全培养基50μL,37℃避光,5%CO2培养30min。弃去培养基,DMEM高糖培养基100μL/孔漂洗1次。采用MolecularDevices公司的ImageXpressMicroXLS系统进行活细胞成像。图像的处理采用CellomicsBioApplication软件,选择Hoechst33258、TMRM、Calcein-AM通道,计算细胞数量、细胞核面积、细胞核DNA含量、线粒体膜电位和Ca2+荧光强度,考察药物对细胞生存率、细胞形态、线粒体功能及Ca2+超载的影响。

2.4统计方法

应用GraphPadPrism5.0及SPSS22.0统计软件进行数据处理,符合正态分布以均数±标准差表示,方差齐则多组间比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA),组间多重比较采用LSD检验进行统计。P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1多柔比星对H9C2细胞的作用

与对照组相比,多柔比星(5、10μmol/L)抑制细胞增殖,使细胞核面积、DNA含量减少,Ca2+荧光强度、线粒体膜电位增加(P<0.05或P<0.01),表明本实验所采用的分析方法是可靠的。结果见表1。图1示多柔比星组细胞数量减少、细胞核发生皱缩,线粒体膜电位发生改变,蓝色荧光减弱(细胞核面积减少),细胞内Ca2+荧光(绿色)强度增强。

表1不同浓度多柔比星作用于H9C2细胞24h的细胞毒性

图1不同浓度多柔比星对H9C2细胞的作用(×200)

3.2乌头碱对H9C2细胞的作用

与对照组相比,在乌头碱浓度为10μmol/L时,H9C2细胞核DNA含量、细胞内Ca2+荧光(绿色)强度增加(P<0.05或P<0.01);当乌头碱浓度为20μmol/L时,细胞内Ca2+荧光强度增加、细胞线粒体膜电位升高(P<0.01)。结果见表2、图2。

表2不同浓度乌头碱作用于H9C2细胞24h的细胞毒性

图2不同浓度乌头碱对H9C2细胞形态的影响(×200)

3.3诃子鞣酸对H9C2细胞的作用

5、10、20μmol/L诃子鞣酸作用于H9C2细胞24h后,细胞数量、细胞核面积、细胞核DNA含量、线粒体膜电位和胞内Ca2+荧光强度均未发生明显的改变,说明诃子鞣酸在5、10、20μmol/L时对H9C2细胞无明显的毒性作用。结果见表3、图3。

3.4诃子鞣酸对乌头碱致H9C2心肌细胞毒性的作用

由3.2项、3.3项结果可知,20μmol/L诃子鞣酸对H9C2细胞无毒性,而乌头碱在此浓度下会引起Ca2+超载,且会导致线粒体功能障碍,具有明显的心肌细胞毒性,故选择20μmol/L乌头碱和不同浓度的诃子鞣酸联用,培养基稀释后分别作用于H9C2细胞24h。

与对照组相比,乌头碱组的细胞内Ca2+荧光强度增加(P<0.01),线粒体膜电位升高(P<0.01);诃子鞣酸和乌头碱作用于H9C2细胞时,当诃子鞣酸与乌头碱浓度比为1∶4时,与单独使用乌头碱相比,各指标差异无统计学意义(P>0.05);随着诃子鞣酸用量增大,即诃子鞣酸和乌头碱浓度比为1∶2和1∶1时,线粒体膜电位和细胞内Ca2+荧光强度比乌头碱组降低(P<0.05或P<0.01),且诃子鞣酸和乌头碱浓度比为1∶1时,与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表4、图4。

表3不同浓度诃子鞣酸作用于H9C2细胞24h的细胞毒性

4、讨论

乌头碱主要存在于川乌、草乌、附子等植物中,具有较高的药用价值,也是主要的毒效成分,其直接损伤心肌细胞,诱发不同程度的心律失常[2]。雷怀成等[12]通过HE染色及凋亡细胞检测技术对大鼠乌头碱中毒后心肌病理变化进行系统研究,结果表明大鼠在中毒后的不同时间段,心肌细胞凋亡数均高于正常对照组,且同一器官的凋亡细胞数在不同时间段差异有统计学意义(P<0.01)。乌头碱诱导心律失常主要与乌头碱破坏细胞内Ca2+稳态[13]、激活内质网钙释放通道兰尼碱受体(RyR2)[14]等有关。乌头碱可加剧Ca2+过载,导致心律失常,最终通过蛋白激酶的磷酸化作用促进细胞凋亡发展[15]。此外,乌头碱可抑制一系列呼吸酶的活性,造成心肌细胞能量代谢障碍,并可导致心肌细胞膜系统破坏,特别是线粒体肿胀等[16,17]。

草乌为中医、蒙医常用药,生草乌含有大量剧毒双酯型生物碱,2015版《中国药典》规定必须先煎久煎,以降低毒性。在蒙医临床应用中,草乌常配伍大量诃子使用以达到解毒目的。现代研究表明,蒙药诃子有保护心肌、缓解乌头碱对心肌毒性的作用[18];诃子提取物可减轻H2O2对心肌细胞的损伤程度,对心肌细胞具有保护作用,其机制可能与稳定细胞膜和抗氧化有关[10]。

图3不同浓度诃子鞣酸对H9C2细胞形态的影响(×200)

表4不同浓度诃子鞣酸对乌头碱致H9C2细胞毒性的作用

图4不同浓度诃子鞣酸对乌头碱致H9C2细胞毒性的作用(×200)

作为蒙医药特色炮制方法,本课题组对诃子制草乌的炮制减毒原理进行了大量研究。前期研究发现,诃子制草乌对小鼠的急性毒性明显低于生草乌,炮制后可以达到减毒的目的[7]。为了进一步明确诃子制草乌的减毒原理,尤其是辅料诃子在炮制减毒过程中的贡献,本实验以草乌中主要毒性成分乌头碱和诃子制草乌中主要引入的辅料成分诃子鞣酸为研究对象,观察2者联用对心肌细胞的影响。

研究结果表明,20μmol/L乌头碱可造成心肌细胞内Ca2+超载和线粒体功能障碍,当配以不同浓度的诃子鞣酸后,心肌细胞内Ca2+超载和线粒体膜电位升高现象均得到改善,诃子鞣酸浓度越高,改善越明显。这说明诃子鞣酸对心肌细胞线粒体具有保护作用,可抑制乌头碱引起心肌细胞Ca2+超载,从而减轻心律失常的发生,这可能是诃子制草乌炮制减毒原理之一。

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