脑梗死具有发病率高、致残率高、死亡率高的特点,给社会和家庭带来了巨大的负担和痛苦[1]。我国70%脑梗死是由于各种原因导致局部脑组织区域血液供应障碍,出现脑组织缺血缺氧性病变坏死,从而产生相应的神经功能缺损表现[2]。尽管脑梗死急性期进行重组人组织型纤溶酶原激活物(rt-PA)溶栓和机械取栓等方法可在一定程度上达到干预缺血半暗带、减少死亡率及残障率的目的,但其使用有时间限制并伴有出血风险[3]。医圣张仲景所创立的侯氏黑散是治疗脑梗死的重要方剂,其组方配伍严谨,疗效确切,在临床中应用广泛。前期研究发现,侯氏黑散可以减少淀粉样物质沉积,稳定神经血管单位内部环境,同时调节相关血管生长因子,促进缺血区脑血管新生,起到神经血管的保护作用[4]。

有研究表明,神经血管保护药物和神经血管再生疗法,是克服脑梗死的必要措施[5]。目前,保护神经血管单元已成为脑梗死治疗的主要目标[6]。磁共振成像(MRI)是临床和临床前研究中应用最广泛的技术之一,可以用来观察脑缺血动物模型脑损伤的动态演变进程,以及评价药物对于脑功能恢复的影响[7]。本研究通过多模式MRI技术,包括T2加权成像(T2-weightedimaging,T2WI)、T2弛豫成像(T2-relaxometrymapping)、磁共振血管造影和动脉自旋标记灌注加权成像为侯氏黑散对大鼠脑缺血后神经血管功能的保护作用提供实验依据。

1、材料

1.1动物

雄性SD大鼠43只,SPF级,7～8周龄,(300±20)g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动物生产许可证号:SCXK(京)2016-0011。饲养在首都医科大学实验动物中心动物房。

1.2伦理审查

本研究经首都医科大学实验动物伦理委员会审查批准,批号:AEEI-2019-001。

1.3主要仪器及设备

PharmaScan®公司7.0T小动物核磁共振成像仪(德国Bruker公司),气体麻醉系统(美国JDMedicalDist公司),核磁共振兼容小动物监测和门控系统(model1025型,SAInstuments公司)。

1.4主要药品和试剂

依据《金匮要略》中侯氏黑散原方比例[8]称取各味药材,30%乙醇回流提取2次(第一次10倍量溶剂2h,第二次8倍量溶剂2h)过滤,滤液分别于50℃减压回收至无醇味,继续浓缩至棕黑色黏稠状,提取液约含生药1.05g/mL[9],备用。所有中药饮片购自北京同仁堂前门总店,经首都医科大学中医药学院李佳副教授鉴定后使用。

银杏叶提取物片(商品名:金纳多),规格40mg/片,由德国威玛舒培博士药厂生产(批准文号:H20140768)。

2、方法

2.1永久性脑缺血模型制备

永久性大脑中动脉栓塞模型按照参考文献[10]及实验室前期建立的方法制作[4]。先用5%异氟烷诱导大鼠麻醉,仰卧固定,然后用2%异氟烷维持麻醉。通过颈正中切口显露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉,使用显微手术夹暂时夹住颈外动脉和颈内动脉,将预先处理成圆头的尼龙线(直径0.265mm)通过右侧颈外动脉插入,轻轻置入颈内动脉腔内,阻断大脑中动脉的起始处,结扎并缝合。假手术组大鼠麻醉后,仅暴露颈内外动脉分支,不进行大脑中动脉闭塞处理。

按照改进的ZeaLonga5级评分法[10],于术后6h进行神经功能评分。评分标准:0分:无明显神经症状;1分:不能完全伸展左侧前爪;2分:向左侧旋转(追尾现象);3分:行走时向左侧倾倒;4分:只在刺激时行走,意识丧失。以评分1～3分者为造模成功,将0分、4分者剔除。

2.2分组及给药

将43只SD大鼠随机分为5组:假手术组7只,模型组、侯氏黑散低剂量组(5.25g/kg)、侯氏黑散高剂量组(10.50g/kg)和银杏叶提取物组(28mg/kg)各9只。假手术组、模型组灌服与给药组同体积的生理盐水,各给药组于术后6h给药1次,之后每24h给药1次。术后第0、1、3、5、7天行神经功能评分,并在7d后进行头颅核磁检测。

2.3MRI数据采集

各组大鼠于pMCAO后7d,在PharmaScan®7.0T小动物核磁共振成像仪上进行磁共振成像。在整个MRI扫描过程中,大鼠经气体麻醉系统用异氟烷麻醉(5%用于诱导,2%用于维持),使用反馈控制水浴系统将大鼠的直肠温度维持在(37.0±0.5)℃,并在整个实验过程中监测呼吸。MRI图像重建采用PharmaScan®Paravisionversion5.1软件(德国Bruker公司)。

2.3.1T2加权成像

T2加权成像(T2WI)可以定量分析脑缺血大鼠梗死体积[11]。采用快速自旋回波序列,扫描参数设置如下:重复时间(repetitiontime,TR)=4400ms,回波时间(echotime,TE)=45ms,反转角=180°,视野(fieldofview,FOV)=33mm×33mm,矩阵=256×256,层数=38,层厚=0.7mm,获得冠状切片的T2WI图像。用ImageJ软件分析各冠状切片的高信号区。脑梗死体积=每层高信号区域的总和×层厚[11]。

2.3.2T2弛豫成像

T2弛豫成像可以显示脑组织的微结构变化,通过测量T2弛豫时间定量分析缺血后脑组织的损伤程度[12]。采用多层多回波(multi-slice-multi-echo,MSME)序列。扫描参数设置如下:16个TE为11、22、33、44、55、66、77、88、99、110、121、132、143、154、165、176ms,TR=2500ms,反转角=180°,FOV=3.3cm×3.3cm,矩阵=256×256,层数=5,层厚=1mm,获取T2驰豫图像。用PharmaScan®Paravisionversion5.1软件分析T2驰豫图像,选择运动皮层(MC)、感觉皮层(SC)、梨状皮层(PiC)、纹状体(Str)、侧脑室边缘(LV)为感兴趣区域(regionofinterest,ROI),并在对侧选择与之对应的区域,获取T2弛豫时间。相对T2弛豫值(rT2)=患侧T2弛豫时间/健侧T2弛豫时间[12]。

2.3.3磁共振血管成像

磁共振血管成像(MRA)可以分析动脉的形态学改变和血流动力学的变化情况[13]。采用快速低角度激发序列,通过三维飞行时间磁共振血管成像(3DTOF-MRA)对颅内主要动脉进行成像。扫描参数设置如下:TR/TE=15/2.5ms,FOV=3.5cm×3.5cm×4.0cm,矩阵=256×256×128,激励次数(numberofexcitation,NEX)=1。MRA图像用PharmaScan®Paravisionversion5.1软件重建,用ImageJ软件分析患侧大脑前动脉(ACA)和大脑后动脉(PCA)的血管信号强度。即在冠状MRA数据集图像上绘制3个ROI,获得相应血管信号强度:第一个ROI描绘血管的轮廓(VE),第二个ROI放置在无血管的背景脑组织上(BG),第三个ROI选择周围空气(AIR),定义为噪声。血管信号强度=(VE-BG)/AIR[13]。

2.3.4动脉自旋标记灌注加权成像

动脉自旋标记灌注加权成像(ASL-PWI)可以检测脑血流灌注的改变,通过测量相对脑血流量(rCBF)的变化评价脑灌注受损程度[14]。脑血流量图是从连续ASL中获得的,采用平面回波成像、液体衰减反转恢复序列。扫描参数设置如下:TR=18000ms,TE=25ms,反转角=90°,FOV=3cm×3cm,反转时间(TI)=300ms,矩阵=128×128,层厚=2mm,NEX=1。用PharmaScan®Paravisionversion5.1软件处理获取CBF图,选择MC、SC、PiC、Str和LV为ROI,并在对侧选择与之对应的区域。相对脑血流量(rCBF)=患侧CBF/健侧CBF[14]。

2.4统计方法

本实验采用SPSS23.0软件进行数据处理。符合正态分布或近似符合正态分布的数据以平均值±标准差表示,若方差齐性多组间比较用单因素方差分析,组间两两比较用LSD检验。不符合正态分布的数据用中位数(四分位区间)[Md(P25,P75)]表示,多组间比较采用Kruskal-WallisH秩和检验,组间两两比较则用Bonferroni法校正P值。以P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1侯氏黑散对脑缺血大鼠神经功能评分的影响

与模型组比较,第5、7天侯氏黑散高剂量组与银杏叶提取物组大鼠神经功能评分降低(P<0.05或P<0.01)。结果见表1。

表1各组对脑缺血大鼠神经功能评分比较

3.2侯氏黑散对脑缺血大鼠梗死体积的影响

假手术组大鼠脑组织结构清晰完整;模型组大鼠缺血侧半球出现明显的异常高亮信号,提示组织缺血梗死。与模型组相比,候氏黑散高、低剂量组及银杏叶提取物组梗死体积减小(P<0.05或P<0.01);与银杏叶提取物组相比,高剂量侯氏黑散梗死体积减小(P<0.05)。结果见表2、图1。

表2各组脑缺血大鼠梗死体积比较

3.3侯氏黑散对脑缺血大鼠脑组织rT2的影响

假手术组大鼠不同脑区rT2值在1左右;模型组大鼠各脑区rT2值较假手术组增加(P<0.01)。与模型组相比,侯氏黑散低剂量组运动皮层和感觉皮层rT2值降低(P<0.05),侯氏黑散高剂量组与银杏叶提取物组各脑区rT2值均降低(P<0.05或P<0.01)。侯氏黑散高剂量组运动皮层区rT2值比银杏叶提取物组降低(P<0.05)。结果见表3、图2。

3.4侯氏黑散对脑缺血大鼠血管信号强度的影响

永久性大鼠中动脉栓塞后动脉的形态学发生改变,主要包括大脑前动脉(ACA)、大脑中动脉(MCA)和大脑后动脉(PCA)。假手术组大鼠颅内动脉形态正常,脉管清晰和完整。模型组和给药组大鼠患侧大脑半球未观察到大脑中动脉,表明栓塞是在该半球血管内形成的。高剂量侯氏黑散和银杏叶提取物可使患侧大脑半球前动脉和后动脉的信号强度增加(P<0.01),且侯氏黑散高剂量组信号强度强于银杏叶提取物组(P<0.05)。结果见图3、表4。

3.5侯氏黑散对脑缺血大鼠脑血流灌注的影响

假手术组大鼠左右脑血流灌注基本保持一致,rCBF在1左右。模型组大鼠各脑区rCBF均较假手术组降低(P<0.01)。与模型组相比,低剂量侯氏黑散可以增加脑缺血大鼠运动皮层、感觉皮层和梨状皮层rCBF(P<0.05);高剂量侯氏黑散与银杏叶提取物均可以增加脑缺血大鼠各脑区rCBF(P<0.05或P<0.01),但侯氏黒散高剂量组运动皮层、纹状体和侧脑室边缘rCBF比银杏叶提取物组增加(P<0.05或P<0.01)。结果见表5、图4。

图1侯氏黑散对脑缺血大鼠梗死体积的影响

表3各组大鼠脑组织rT2值比较

图2侯氏黑散对脑缺血大鼠脑组织rT2的影响

图3侯氏黑散对脑缺血大鼠血管信号强度的影响

表4各组大鼠患侧血管信号强度比较

表5侯氏黑散对脑缺血大鼠相对脑血流量的影响

图4侯氏黑散对脑缺血大鼠脑血流灌注的影响

4、讨论

脑梗死因临床表现与中医学的中风病相似,故多将其归为“中风”病的范畴。侯氏黑散被广泛地应用于脑梗死的临床治疗中,可有效改善脑梗死后遗症肢体偏瘫、失语等症状[15]15]。《金匮要略·中风历节病》篇中记载“侯氏黑散,治大风,四肢烦重,心中恶寒不足者”。内虚邪中是脑梗死的发病原因,风邪乘虚入中经络,其病情重,传变迅速,故称大风;风邪与痰湿相合,痹阻经脉,郁而化热,故四肢苦烦而重滞;心中恶寒不足提示脑梗死发病之根本在于中焦阳气不足,风邪直达于里。方中重用菊花四十分、防风十分。沈明宗《金匮要略论注》曰“菊花、防风能驱表里之风”。人参、白术、茯苓、干姜温补中阳;当归、川芎补血活血;桂枝、细辛温通经脉;牡蛎、矾石、桔梗化痰;黄芩清郁热,并可减姜、桂之燥热。诸药合用,益气温阳,祛风化痰,活血通络,达到扶正祛邪之功。

神经血管单元是一个结构和功能相互依赖的多细胞复合体,由神经元、内皮细胞、基底膜、周细胞和星形胶质细胞组成,每一个组成部分都紧密地相互联系,构成了一个解剖和功能的整体,共同维持着大脑微环境的稳态平衡,从而形成了一个高效的脑血流调节系统,在支持大脑功能方面发挥着重要作用[16]。脑梗死后神经血管单元的复杂交互功能严重受损,导致缺血脑组织广泛的病理损害和功能障碍[17]。目前,脑梗死引起微结构改变的评估主要来自于病理学和组织学测量,且不允许在活体内动态评估这些变化[18]。多参数磁共振成像(MRI)技术是临床和临床前研究中一种非常有价值的多功能成像工具,不会使机体暴露于潜在的有害电离辐射下,可以连续重复地无创监测梗死、灌注和血流动力学以描述脑梗死病灶在“体内”的演变,并可作为评估脑梗死后神经保护疗效的一种新方法[19]。在本研究中,基于行为学观察和多参数磁共振成像技术,我们证实了侯氏黑散能显著改善脑缺血大鼠神经功能,减轻脑组织损伤,调节脑灌注异常,促进神经血管功能的恢复。

神经功能评分作为中风终点指标之一,被广泛应用于临床前研究中,对动物模型进行运动功能、本体感觉等评价,是判断模型建立成功与否的重要依据,也是药物研究中疗效观察的重要参考指标[20]20]。我们通过ZeaLonga5级神经功能评分法初步评价脑缺血后7d内大鼠运动协调能力变化。结果表明脑缺血后5～7d,侯氏黑散高剂量组及银杏叶提取物组大鼠神经功能评分较模型组均降低,提示高剂量侯氏黑散和银杏叶提取物可以改善脑缺血大鼠神经功能损伤,促进肢体运动功能修复。

缺血性病变体积是评价抗脑缺血效应的重要指标[21]。传统上用2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色、组织病理学观察、苏木精-伊红染色或尼氏染色的脑切片测量梗死体积,但随着MRI的效用性越来越高,T2加权成像已被广泛应用于检测脑组织的缺血性改变[22]。同时结合T2弛豫成像可以进一步反映缺血后大鼠不同脑区域损伤严重程度,为脑梗死预后发展提供依据[23]。在pMCAO后第7天,我们在脑缺血大鼠患侧半球的T2WI图像中发现异常高信号,与T2弛豫图像中观察到高信号强度所在区域基本一致。侯氏黑散和银杏叶提取物均可在缺血后7d降低脑梗死体积。此外,给药组患侧皮质和纹状体区域的T2值显著降低,表明侯氏黑散对减轻灰质和白质缺血损伤区域有明显作用。

脑梗死是由于血管闭塞或栓塞导致大脑部分供血受限,引起局部脑血流量的下降,最终导致神经血管一连串级联损伤事件的发生[24]。预后恢复主要取决于灌注的受损和恢复程度,受损的区域越严重越有可能发生不可逆脑损伤,会进一步加重脑梗死的不良预后[6]。因此,恢复缺血区的脑血流灌注是治疗脑梗死的关键,有助于防止脑组织的进一步损伤,促进脑梗死后的神经功能恢复。ASL-PWI是评价缺血后脑灌注程度的理想方法,被广泛应用于闭塞性脑血管疾病,通过使用标记的动脉血作为内源性示踪剂获取灌注图像,利用动力学模式获取脑血流量[25]。同时利用TOF-MRA可以获取高分辨率的血管造影,对PWI监测的组织灌注状态进行补充,有助于更加客观全面地评估血流动力学的损害状态。3DTOF-MRA可以在冠状位、矢状位和轴向位上显示大脑主要动脉及其分支,为其血管解剖提供有价值的信息。侯氏黑散具有显著的神经保护作用,我们通过3DTOF-MRA结合定量ASL-CBF研究了侯氏黑散对缺血后脑血流动力学状态的影响。结果发现,pMCAO大鼠大脑冲动脉供血区MRA信号强度和CBF降低与动脉血管闭塞有关。侯氏黑散和银杏叶提取物治疗后7d,脑缺血大鼠患侧大脑前动脉和大脑后动脉信号强度明显升高,同时患侧缺血区域皮层和纹状体CBF明显升高。这一点与T2弛豫成像评估脑损伤改善结果一致,说明侯氏黑散的缺血神经损伤保护作用和改善缺血后脑血流灌注相关。

综上所述,侯氏黑散和银杏叶提取物治疗不仅能明显改善脑缺血大鼠神经功能缺损,减轻脑组织损伤,还能调节脑灌注异常。此外,10.5g/kg侯氏黑散改善血流动力学的作用优于银杏叶提取物。这项研究从影像学为进一步研究侯氏黑散的神经血管保护作用机制奠定了基础。

参考文献：

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[20]王荣亮,刘小蒙,张营,等.大鼠局灶性脑缺血后神经功能评分与脑梗死体积相关性分析[J].首都医科大学学报,2013,34(1):69-74.

程宏发,王璇,张雅文,赵晖,王蕾,邹海艳,张秋霞.基于磁共振成像研究侯氏黑散对脑缺血大鼠神经血管功能恢复的作用[J].北京中医药大学学报,2020,43(08):680-688.

基金:国家自然科学基金面上项目(No.81373526,No.81873224);北京市自然科学基金项目(No.7102014,No.7122018);北京市属高等学校高层次人才引进与培养计划-长城学者基金支持项目(No.CIT&TCD20140329).